異靛藍(lán)類化合物的設(shè)計、合成及生物活性研究

1、新型異靛藍(lán)類化合物的設(shè)計、合成及生物活性研究中國藥科大學(xué)本 科 畢 業(yè) 論 文 論文題目新型異靛藍(lán)類化合物的設(shè)計、合成及生物活性研究 英文題目Design, synthesis and biological evaluation of novel isoindigo derivatives 專 業(yè) 藥學(xué)（藥物化學(xué)方向） 院 部 藥學(xué)院 學(xué) 號 姓 名 指導(dǎo)教師 課 題完成場所 中國藥科大學(xué)玄武門校區(qū)藥化實驗室論文工作時間：2012年 2 月 至 2012年 5月30新型異靛藍(lán)類化合物的設(shè)計、合成及生物活性研究目錄摘要 2第一章 前言 51.1 異靛藍(lán)的發(fā)現(xiàn)及其抗腫瘤活性 51.2 異靛藍(lán)類CD

2、Ks抑制劑的抗腫瘤機(jī)理 6第二章 目標(biāo)化合物的設(shè)計合成 112.1 設(shè)計思想112.2 合成的化合物162.3 合成路線172.4. 合成討論 18第三章 合成實驗部分 193.1 儀器與試劑193.2 合成方法20第四章 總結(jié) 23參考文獻(xiàn)24致謝26附錄（圖譜） 27新型異靛藍(lán)類化合物的設(shè)計、合成及生物活性研究摘要細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的根本特征。一個細(xì)多種蛋白酶的調(diào)控，調(diào)控失調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，從而引發(fā)腫瘤。以細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶為靶點的藥物可以阻斷細(xì)胞周期，控制細(xì)胞增殖，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。傳統(tǒng)中藥方劑“當(dāng)歸蘆薈丸”中的有效成分青黛具有治療慢性粒細(xì)胞白血病(chromic mye

3、locytic leukemia，CML)的臨床療效，異靛藍(lán)(Isoindigo)是它所含的三種雙吲哚化合物中的一種。異靛藍(lán)及其衍生物的作用機(jī)理是：通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）的作用抑制腫瘤增殖。從改善異靛藍(lán)溶解性，提高化合物選擇性和與靶點親和性的角度出發(fā)，我們設(shè)計合成了四個結(jié)構(gòu)全新的化合物，為了改善靛玉紅的水溶性及脂溶性，提高抗腫瘤活性，保持雙吲哚結(jié)構(gòu)中的一個吲哚，將另一個吲哚替換為2-亞胺-4-噻唑酮或2,4-噻唑二酮，得到3,3-雙鍵的平面多環(huán)縮合產(chǎn)物，并對其進(jìn)行修飾，得到符合CDKs小分子抑制劑特點的化合物； 關(guān)鍵詞 異靛藍(lán)

4、；吲哚酮類化合物；抗腫瘤；細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑； Design, synthesis and biological evaluation of novel isoindigo derivativesAbstract Cell cycle is one of the basic requirements for multicellular organisms. A whole cell cycle is regulated by a series of enzymes. Faulty regulation of the control mechanism in the cell cycle

5、 leads to an excessive cell proliferation and is the cause of cancer. The drug whose target is cyclin-dependent kinases could interrupt the cell cycle, inhibit the cell proliferation and then achieve in battling cancer. “Danggui Luhui Wan”，the Tranditional Chineses Medicine recipe was used to aganis

6、t chromic myelocytic leukemia in clinic, whose only active ingredient is Indigoids containing three dis-indole compounds. Isoindigo is one of them. The mechanism of isoindigo and its analogues is to inhibit the cyclin dependent kinases potently and selectively so as to inhibit the growth of the tumo

7、r cells. Aiming at improving solubility, selectivity and affinity of isoindigo, we intend to synthesize four series of new compounds. In the first three series, for sake of improving isoindigos hydrosolubility and liposolubility, enhancing the antitumor activity, we replace one indole moiety of dis-

8、indole structure into 2-iminothiazolidin-4-one and thiazolidine-2,4-dione, getting compounds with 3,3-double bond, which ensure the planarity of the molecule. With further modification, we get three series of new compounds that satisfying the characteristics of CDKs inhibitors. The compounds of four

9、th serial, based on the second serial, are conjuagated with polyamine moiety (tetramethylenediamine), which modified with phthalimide. We expect that polyamine moiety would bring the compounds better solubility, better selectivity and better affinity. In vitro cell-based assay was performed towards

10、the library against HeLa cells, SGC cells and HepG2 cells, after which several rules could be conclude, preparing for further study.Keywords isoindigo; indolone analogues; anticancer; Cyclin-dependent kinases（CD Ks）inhibitor; polyamine一 前 言1.1 異靛藍(lán)的發(fā)現(xiàn)及其抗腫瘤活性迄今為止，中國傳統(tǒng)醫(yī)藥的發(fā)展已經(jīng)歷經(jīng)四千多年，人類從中獲得了大量有價值的藥物。其中許多

11、化合物已經(jīng)表現(xiàn)出具有重要意義的抗腫瘤活性，比如喜樹堿和紫杉醇。1969年，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院輸血及血液學(xué)研究所報道了當(dāng)歸蘆薈丸治療慢性粒細(xì)胞白血病的臨床療效，并進(jìn)一步證明青黛為其有效藥味。青黛中的主要成分含有靛玉紅(indirubin,)，靛藍(lán)(indigo,)和異靛藍(lán)(isoindigo,)1ac。與靛藍(lán)相比，靛玉紅和異靛藍(lán)均包含吲哚-2-酮結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)片段已經(jīng)被證實是多種蛋白激酶的ATP競爭性抑制劑。近年來，不斷的研究表明，異靛藍(lán)(isoindigo)及其衍生物通過與ATP競爭細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDKs上的結(jié)合位點，抑制CDKs的活性，從而阻滯腫瘤細(xì)胞的增殖2。但異靛藍(lán)本身水溶性及脂

12、溶性均較差，經(jīng)口給藥限制其吸收。為尋找比異靛藍(lán)更理想的新化合物，提高療效，降低毒副作用，人們對異靛藍(lán)進(jìn)行了大量的結(jié)構(gòu)改造。1.2 異靛藍(lán)類CDKs抑制劑的抗腫瘤機(jī)理1.2.1 細(xì)胞周期的概念細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程。細(xì)胞周期(cell cycle)也稱細(xì)胞生活周期(cell life cycle)或細(xì)胞增殖周期(cell reproductive cycle), 是指細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個序貫過程。一個標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞周期通?？蓜澐譃?個連續(xù)的時相: G1期(合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(合成后期)、M期(有絲分裂期)。G1期是細(xì)胞周期的第一階段

13、. 在這一時期，細(xì)胞開始合成各種蛋白質(zhì)、糖類和脂質(zhì)等, 形成大量的細(xì)胞器, 使細(xì)胞不斷生長變大, 同時為細(xì)胞進(jìn)入S期, 進(jìn)行DNA復(fù)制做好準(zhǔn)備。S期即DNA合成期。經(jīng)過S期后，DNA的含量及其攜帶的遺傳信息增加了1倍，細(xì)胞開始進(jìn)人G2期，為細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備。M期為細(xì)胞分裂期。在M期，細(xì)胞一分為二，遺傳物質(zhì)也隨之平均分配到兩個子代細(xì)胞中，整個細(xì)胞周期完成3。1.2.2 細(xì)胞周期調(diào)控因子細(xì)胞周期調(diào)控因子有兩種, 一種是細(xì)胞周期正控蛋白, 包括細(xì)胞周期蛋白(cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)；另一種是細(xì)胞周期負(fù)控蛋白，細(xì)胞周期蛋白依賴性

14、激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKI) 。1.2.2.1細(xì)胞周期蛋白(cyclins)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)細(xì)胞周期蛋白(cyclins)是一類與細(xì)胞周期功能狀態(tài)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，其表達(dá)水平隨著細(xì)胞周期發(fā)生漲落，可通過與在整個細(xì)胞周期中表達(dá)相對恒定的相應(yīng)的CDK結(jié)合后形成復(fù)合物, 激活CDK的激酶活性, 對細(xì)胞內(nèi)底物進(jìn)行磷酸化, 然后迅速降解失活，從而在細(xì)胞周期的不同階段發(fā)揮調(diào)控作用。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)是一類重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 它只有在與cyclin結(jié)合之后才能表現(xiàn)出蛋白激酶的活性。細(xì)胞周期

15、過程中，cyclins周期性的連續(xù)表達(dá)或降解，并分別連接到由它們瞬間活化的CDKs上，推動細(xì)胞跨越細(xì)胞周期各時相轉(zhuǎn)換的限制點(restriction point，R點)或檢驗點(checkpoint)4，使細(xì)胞完成由G1 - S - G2 - M各期的轉(zhuǎn)換過程，在細(xì)胞分裂增殖的調(diào)控中處于核心地位。人體中CDKs有9個亞型 (CDK19)，cyclins有11個亞型(AJ)，不同的CDKs分別連接不同的cyclins或cyclin的亞基，形成不同的cyclin和CDK復(fù)合物調(diào)控G1/S或G2/M過程的轉(zhuǎn)換。D型cyclins，包括D1，D2和D3，作為多種促有絲分裂信號的感應(yīng)物質(zhì)，能夠激活CDK

16、4和CDK6推動G1期的進(jìn)程。CDK2-cyclinE(E1和E2)復(fù)合物在G1期末被激活，參與G1期到S期的轉(zhuǎn)換過程。到S期末以及進(jìn)入G2期后，A型cyclins(A1和A2)取代E型cyclins激活CDK2和CDK1。最后，CDK1和cyclinB(主要是B1和B2)形成有絲分裂復(fù)合物，推動細(xì)胞由G2期向M期的轉(zhuǎn)換(圖1)5。1.2.2.2 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKIs)CDKIs是CDKs抑制劑，可阻止細(xì)胞通過限制點，具有抑癌基因的活性，它的作用方式是直接與CDKs或cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。CDKIs包括p21，p27等。1.2.3 細(xì)胞周期調(diào)控

17、與腫瘤細(xì)胞周期是一個高度有序的運轉(zhuǎn)過程，在細(xì)胞周期G1和G2期中分別都有限制點(checkpoints)，它們的存在，能確保完整的DNA通過這些周期分隔線。G1限制點保證了缺陷DNA得到修復(fù)后進(jìn)入S期，G2限制點保證DNA在細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂(即M期)前的完整性5。細(xì)胞周期的正確運轉(zhuǎn)是在適宜的環(huán)境中，通過對cyclin/CDK復(fù)合物的活性進(jìn)行精確調(diào)控來實現(xiàn)的6。研究表明，以CDK為中心的細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)任何環(huán)節(jié)的異常，都將引起細(xì)胞周期異常而最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞周期依賴性激酶(CDKs)異常幾乎存在于所有的腫瘤細(xì)胞中。引起CDKs異常的原因目前已知有以下幾個方面。第一，在許多腫瘤組織中，cyc

18、lin常常過度表達(dá)，使CDKs分子持續(xù)活化，導(dǎo)致細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)異?；钴S。第二，在腫瘤組織中常有CDK和調(diào)節(jié)亞基的過度表達(dá)。胃癌、乳腺癌、淋巴瘤、兒童髓母細(xì)胞瘤和頭頸鱗癌腫瘤組織中常有CDK4基因的擴(kuò)增、突變或高表達(dá)。CDK2基因突變引起的自身過度活化、CDK2和周期蛋白E協(xié)同異常表達(dá)，也與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。在膀胱癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌的腫瘤組織中，常有CDK2異常表達(dá)和較高的活性。第三，腫瘤細(xì)胞中CDKI基因常常出現(xiàn)突變或者缺失, 使CDKI對CDKs的負(fù)向調(diào)控作用降低或完全喪失7。抑制細(xì)胞周期激酶，可有效地阻止細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分化成熟，或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療多種腫瘤的作用

19、，這類藥物應(yīng)具有較低的毒副作用。基于CDKs在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和死亡中所起的關(guān)鍵作用，CDK激酶家族為抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)與研制提供了機(jī)會和新的領(lǐng)域。圖1 cyclin-CDKs復(fù)合物調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用1.2.4異靛藍(lán)類CDKs抑制劑的抗腫瘤機(jī)理幾乎所有腫瘤細(xì)胞都具有各種各樣的細(xì)胞周期激酶異常, 或是細(xì)胞周期因子高度表達(dá), 或是細(xì)胞周期激酶高度活化, 或是內(nèi)源性抑制蛋白缺失3,7。目前已有的小分子CDKs抑制劑主要是通過抑制過度表達(dá)的CDKs的活性，達(dá)到抗腫瘤的效果。由于CDKs是具有激酶活性的, 因此需要通過結(jié)合ATP后使得其氨基酸殘基磷酸化從而發(fā)揮其生理, 生化作用。CDKs的一級序列存在高

20、度同源性，它們之間一級序列的高同源性暗示了三維結(jié)構(gòu)的相似性。CDKs和別的蛋白激酶相似，結(jié)構(gòu)上有著共同的特征：折疊組成的小的N末端和長的a螺旋組成的C末端，ATP結(jié)合口袋在這兩末端形成的域之間，cyclin的結(jié)合導(dǎo)致CDK結(jié)構(gòu)變化使CDK處于活化的構(gòu)象。以CDK2為例，ATP與CDK2結(jié)合模型如圖2，ATP與CDK2通過氫鍵作用結(jié)合，與ATP形成氫鍵作用的氨基酸殘基分別為THR 14, LYS 33, GLU 81, ASP 86, ASP 127, LYS 129，ASN 132, ASP 145, Leu 83, Gln 131。設(shè)計出的化學(xué)小分子如果能競爭性的抑制ATP的作用，就可以導(dǎo)致

21、激酶失活, 從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。圖 2 ATP與CDK2的結(jié)合模型由于靛玉紅在慢性粒細(xì)胞白血病中所起的顯著作用，目前大部分的研究集中于靛玉紅。然而靛玉紅本身水溶性差，影響口服生物利用度，并且已有報告指出，靛玉紅有胃腸道副作用。因此，尋找替代靛玉紅的更具有成藥性的分子是很有必要的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有前途的候選化合物分子包括3-靛玉紅肟，甲異靛和Natura(圖3)。靛玉紅是有效的CDKs抑制劑，以ATP競爭性方式進(jìn)行，通過氫鍵作用與CDK2的ATP結(jié)合部位的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合。靛玉紅類化合物中的吲哚-2-酮結(jié)構(gòu)與CDK2的肽骨架中的Glu81和Leu83間形成三個氫鍵, 深入ATP結(jié)合袋的內(nèi)部

22、(圖4)。異靛藍(lán)類衍生物，如甲異靛和Natura，與靛玉紅一樣，具有吲哚-2-酮結(jié)構(gòu)。Mathieu等人2對一系列糖基取代的異靛藍(lán)研究表明，1-糖基取代異靛藍(lán)Compound A活性最好，其IC50值為0.14M。Compound A和其他具有吲哚-2-酮結(jié)構(gòu)的化合物一樣，通過內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)部分，依靠兩個氫鍵與CDK2結(jié)合，其中，酰胺的NH部分與肽骨架中Glu-81的羰基結(jié)合，酰胺的羰基氧與肽骨架中Leu-83的NH結(jié)合(圖5)。鑒于對靛玉紅的進(jìn)一步研究受到國外公司專利保護(hù)的影響，為了開辟新的研究方向，同時進(jìn)一步改善這類雙吲哚化合物性質(zhì)，提高療效，我們決定從異靛藍(lán)結(jié)構(gòu)著手，進(jìn)行新的結(jié)構(gòu)改造。圖3

23、3-靛玉紅肟，甲異靛和Natura的結(jié)構(gòu)圖4 a)ATP與CDK2結(jié)合模式示意圖；b)靛玉紅類衍生物與CDK2結(jié)合模式示意圖圖5 Compound A與CDK2結(jié)合的示意圖(淺灰部分為疏水殘基，灰色部分為極性殘基，黑色部分為帶電荷的殘基)二 目標(biāo)化合物的設(shè)計合成2.1 設(shè)計思想CDKs抑制劑雖然結(jié)構(gòu)各異，但所有CDKs的小分子抑制劑有一些共同的特點8：(1)一般小的分子量(<600)；(2)平面、疏水性的多環(huán)化合物；(3)主要通過和ATP競爭來占據(jù)酶的ATP結(jié)合口袋；(4)主要通過疏水和氫鍵作用和酶結(jié)合；(5)一般與Leu83和Glu81形成氫鍵。異靛藍(lán)類衍生物滿足CDKs的小分子抑制劑

24、上述一些共同的特點，最重要的是它具有吲哚-2-酮結(jié)構(gòu)，能夠保持與Leu83和Glu81的氫鍵作用。吳克美等人9-11分別在靛藍(lán)和異靛藍(lán)的N-1上引入甲基、乙基和丙基，合成出如表2-1所示的靛藍(lán)和異靛藍(lán)衍生物，與相應(yīng)的靛玉紅衍生物進(jìn)行抗腫瘤活性對比，見表2-1。表2-1 靛玉紅()、靛藍(lán)()和異靛藍(lán)()的N-1-烷基取代物及其抗腫瘤活性比較No.R抑制率%No.R抑制率%No.R抑制率%WLWLWL-aCH341.550.0-aCH351.538.2-aCH367.050.0-bC2H557.938.2-bC2H554.644.1-bC2H548.538.2-cC3H753.927.2-cC3H

25、715.045.5-cC3H712.539.1注: W為Walker-256; L為Lewis肺癌.表2-1中的結(jié)果表明, 在靛藍(lán)和異靛藍(lán)分子中的N-1位引入甲基和乙基, 抗大鼠Walker-256和Lewis肺癌細(xì)胞的活性均與相應(yīng)的靛玉紅衍生物一致; 但當(dāng)取代烷基為丙基時, 前兩種異構(gòu)體抗Walker-256的活性幾乎消失, 對Lewis肺癌仍有一定的抑制活性. 由此可見, 在青黛類雙吲哚化合物中N-1位是一個重要的結(jié)構(gòu)修飾位點。從表2-1中可清楚地看到, N(1)-甲基異靛藍(lán)(簡稱甲異靛, meisoindigo, -a)對Walker-256的抑制活性是所有雙吲哚衍生物中最高的34, 實

26、驗及臨床研究表明, 甲異靛比靛玉紅療效好, 毒性低35, 現(xiàn)已成為治療CML的國家級一類新藥12。甲異靛 (-a)也和靛玉紅一樣, 可觀察到在體外對Walker-256癌細(xì)胞的DNA生物合成有明顯抑制作用. 在100mol/L濃度下, 對拓樸異構(gòu)酶I和II, 以及DNA多聚酶均無明顯的影響. 此外, 甲異靛在最為適合于細(xì)胞分化誘導(dǎo)濃度 (如0.72 g/mL)下, 可促小鼠原粒細(xì)胞白血病ML-1細(xì)胞分化和凋亡13,14。利用高通量篩選技術(shù)鑒別出吲哚-2-酮類化合物(16)是CDK4/D1溫和的抑制劑15，(16) 能在低于1微摩爾范圍內(nèi)抑制人類乳腺癌細(xì)胞的增殖(MCF-7: IC50=0.42

27、 µM)。3,5-二取代吲哚-2-酮衍生物SU9516選擇性相似于MAZ31，優(yōu)先地阻斷CDK2 (IC50=0.022 µM), CDK1 (IC50=0.04 µM) 和CDK4 (IC50=0.2 µM)16. 其他蛋白激酶, 如PKC, p38, PDGFR和EGFR, 在較高濃度受SU9516所影響 (IC50>10 µM)。另一種吲哚-2-酮衍生物MAZ31在低于1微摩爾的范圍內(nèi)抑制VEGFR-3, 已作為第一個淋巴血管發(fā)生的小分子抑制劑17。SU5416作為VEGF-2的選擇性抑制劑已進(jìn)入臨床試驗1820. 2008年10月

28、，美腫瘤學(xué)年會(ASCO)公布舒尼替尼(索坦)能顯著延長晚期腎癌患者的生存期。它是口服多靶點抗癌藥，能選擇性作用于腫瘤； 生長、血管生成和多個受體酪氨酸激酶(RTKs)。它還可用于伊馬替尼治療失敗或不能耐受的晚期胃腸間質(zhì)瘤(GIST)的治療。 綜上所述，甲異靛，natura，以及一系列吲哚-2-酮類化合物都具有CDK抑制活性，說明這類具有吲哚-2-酮結(jié)構(gòu)的化合物與CDK結(jié)合主要依靠雙吲哚結(jié)構(gòu)其中一個吲哚的內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)2，3,3-雙鍵是保持分子平面性的關(guān)鍵，因此是必需的，而甲異靛的活性很好，說明N-1上用較小的基團(tuán)取代可以有較好的效果。而目前已有的對其進(jìn)行的結(jié)構(gòu)改造，主要是為了改善其溶解性，因此，

29、我們擬保留其中一個吲哚結(jié)構(gòu)，對另一個吲哚結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。我們對異靛藍(lán)進(jìn)行的結(jié)構(gòu)改造如下：目標(biāo)系列一化合物：1. 保持雙吲哚結(jié)構(gòu)中的一個吲哚，主要利用其內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，保證目標(biāo)化合物分子能以氫鍵作用結(jié)合到CDK的ATP結(jié)合口袋中，對另一個吲哚進(jìn)行改造；2. 異靛藍(lán)的抗腫瘤活性不理想，而在N-1位引人甲基或乙基后，化合物的抗腫瘤活性顯著增加，因此，對目標(biāo)新化合物的N-1位進(jìn)行修飾；3. 根據(jù)文獻(xiàn)報道，靛紅與4-噻唑酮縮合的產(chǎn)物能抑制淋巴肉瘤LYO-1及Ehrlich瘤的生長19。我們保留一個吲哚結(jié)構(gòu)，將另一個吲哚替換為2-亞胺-4-噻唑酮，得到3,3-雙鍵的平面多環(huán)縮合產(chǎn)物，符合CDKs小分子抑制劑的結(jié)

30、構(gòu)特點。這樣的縮合產(chǎn)物在具有抗腫瘤活性的同時，還能利用其互變形成帶有氨基的結(jié)構(gòu)，改善異靛藍(lán)的水溶性。目標(biāo)系列一和目標(biāo)系列二化合物：1. 同樣保持一個吲哚結(jié)構(gòu)，并在N-1位進(jìn)行修飾；2. 文獻(xiàn)報道，偶聯(lián)的2,4-噻唑二酮具有抗腫瘤活性。將靛紅與2,4-噻唑二酮縮合，得到目標(biāo)系列二化合物。3. 已有的數(shù)據(jù)說明，異靛藍(lán)類化合物水溶性與活性沒有線性的關(guān)系?；衔?7和18與甲異靛相比，溶解性下降了120多倍，然而抑制K562腫瘤細(xì)胞的能力卻增強(qiáng)了19。對一系列N-1糖基取代的異靛藍(lán)的研究發(fā)現(xiàn)，糖基上的羥基被芐基或乙酰基保護(hù)的產(chǎn)物，其對CDK抑制的IC50在0.10.2mol之間，而糖基上羥基未被保護(hù)的

31、化合物對CDK幾乎沒有任何抑制作用，也就是說異靛藍(lán)類衍生物的脂溶性和水溶性必須在一個合適的范圍才能使化合物分子具有活性2。因此，為了測定不同溶解性的同一系列母核化合物的活性，對目標(biāo)系列二化合物進(jìn)一步修飾得到目標(biāo)系列三化合物。 IC50=7.75M IC50=1.70M IC50=1.75M Solubility=673M Solubility=5.3M Solubility=4.9MIC50是化合物作用于K562腫瘤細(xì)胞測定的值；Solubility是ACD/Labs 12.0 Solubility DB測定的25，pH7.4時化合物的水溶性。2.2 合成的化合物根據(jù)上述設(shè)計思想，我們設(shè)計合成

32、了四個全新化合物。系列一系列二2.3 合成路線2.3.1中間體1-烷基-取代吲哚-2,3-二酮的合成式中：R=7-F；R1=Me以7-氟靛紅為原料，DMF做溶劑，在K2CO3催化下進(jìn)行反應(yīng)，在其1-位發(fā)生烴基化，反應(yīng)液倒入水中后析出產(chǎn)物，無需純化，即得到1-烷基-取代吲哚-2,3-二酮衍生物。2.3.2中間體2-亞胺-4-噻唑酮和2,4-噻唑二酮的合成 以硫脲與氯乙酸乙酯為原料，乙醇做溶劑的條件下回流，得到的2-亞胺-4-噻唑酮鹽酸鹽，再用醋酸鈉游離出中間體2-亞胺-4-噻唑酮。中間體在20%HCl中回流得到中間體2,4-噻唑二酮20。2.3.3目標(biāo)系列一化合物(Z)-2-亞胺基-5-(2-氧

33、代取代吲哚-3-亞基)噻唑-4-酮的合成式中：7-F；R1=H,Me 將取代吲哚-2,3-二酮或中間體1-烷基-取代吲哚-2,3-二酮與中間體2-亞胺-4-噻唑酮加入溶有熔融醋酸鈉的冰醋酸溶液中，加熱回流得到目標(biāo)化合物。2.3.4目標(biāo)系列二化合物(Z)-5-(2-氧代取代吲哚-3-亞基)噻唑-2,4-二酮的合成式中：R=7-F；R1=H,Me將取代吲哚-2,3-二酮或中間體1-烷基-取代吲哚-2,3-二酮與中間體2,4-噻唑二酮(c)加入溶有熔融醋酸鈉的冰醋酸溶液中，加熱回流得到目標(biāo)化合物。2.4. 合成討論2.4.1 對以往合成1-烷基-取代吲哚-2,3-二酮的方法進(jìn)行改進(jìn)，用K2CO3代替

34、傳統(tǒng)合成路線中的NaH，提高了反應(yīng)的安全性，以及操作的方便性。以往合成方法中使用NaH，在投料過程中，加入NaH后放熱，使反應(yīng)液溫度驟然升高，如果在這種情況下直接加入鹵代烷，反應(yīng)的副產(chǎn)物大大增加，產(chǎn)物的產(chǎn)率較低。因此投料時需采用冰浴控制反應(yīng)溫度，并且NaH需分次逐步加入，加完后待反應(yīng)液溫度達(dá)到室溫或以下后，再加入鹵代烷，才能使產(chǎn)率較高。此外，以往的反應(yīng)條件下，副反應(yīng)較多，需通過柱層析純化后得到產(chǎn)品繼續(xù)反應(yīng)。而使用K2CO3作為反應(yīng)中所需的堿和縛酸劑，在反應(yīng)結(jié)束后，濾除反應(yīng)中生成的鉀鹽以及未反應(yīng)完的K2CO3，將反應(yīng)液倒入水中，即可析出產(chǎn)物，薄層檢測為單一產(chǎn)物，無需純化即可投入下一步。2.4.2

35、根據(jù)異靛藍(lán)的構(gòu)型判斷，目標(biāo)產(chǎn)物的構(gòu)型為Z型。Yuan21等人的研究表明，異靛藍(lán)為E構(gòu)型，C=C作為反式構(gòu)型的中心，連接兩個共平面的吲哚-2-酮結(jié)構(gòu)，C2-C3=C3-C2形成共軛的體系。由此，我們推斷，目標(biāo)系列化合物與異靛藍(lán)一樣，兩個羰基分布在中心C=C兩側(cè)，噻唑酮環(huán)上的N上的孤對電子參與共軛體系，形成吲哚-2-酮環(huán)與噻唑酮環(huán)整體共軛的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。三 合成實驗部分3.1 儀器與試劑熔點用Mel-TEMP熔點儀測定，溫度計未經(jīng)校正；旋光用JASCO P-1020型旋光儀測定；1H NMR譜用Bruker AV-300型核磁共振儀測定，內(nèi)標(biāo)TMS，不特別說明，所用溶劑為CDCl3或D6-DMSO；H

36、RMS用Agilent Q-TOF 6520高分辨質(zhì)譜儀測定。薄層層析(TLC)板采用硅膠GF254(青島海洋化工廠生產(chǎn))自制，于紫外燈下(波長254nm和365nm)顯色；柱層析采用100-200目或200-300目硅膠(青島海洋化工廠生產(chǎn))；試劑均為市售化學(xué)純或分析純產(chǎn)品，除特別說明外，不經(jīng)處理直接使用。3.2 合成方法中間體1-烷基-取代吲哚-2,3-二酮的合成1-甲基-7-氟-吲哚-2,3-二酮7-氟-吲哚-2,3-二酮3g(0.018mol)，將其完全溶于20mlDMF中，稱取6g(0.043mol) K2CO3炒干，將冷卻的無水K2CO3加入反應(yīng)液中，攪拌約5分鐘后，向反應(yīng)液中滴加

37、2.78ml(0.045mol)碘甲烷，薄層色譜監(jiān)控反應(yīng)，約2小時后，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液倒入250ml水中，充分?jǐn)嚢?，有橙黃色固體析出，靜置析晶，過濾，濾餅用水洗三次，干燥，得到2.86g橙黃色固體，收率88.3%，m.p.148150，薄層色譜檢測只有一個點，直接投入下一步反應(yīng)。中間體2-亞胺-4-噻唑酮硫脲15.2g(0.2mol)加入95%乙醇100ml中，攪拌回流至完全溶解，再慢慢滴加氯乙酸乙酯21.6ml(0.2mol)，滴加完畢，回流3小時，反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，抽濾，用少量乙醇洗滌，干燥，得到白色晶體26.5g。將上述白色晶體26.5g(0.23mol)溶于252ml沸水中，向其

38、中加入溶有15.4g(0.19mol)醋酸鈉的31.5ml沸水溶液，攪拌，有大量固體析出，冷卻，出現(xiàn)大量白色針狀晶體，抽濾，水洗，干燥，得到白色針狀晶體18.9g，收率81.5%，m.p.256258，與文獻(xiàn)51一致。中間體2,4-噻唑二酮的合成將2-亞胺-4-噻唑酮8.9g(0.07mol)加至20%鹽酸(88ml)中，回流10小時，濃縮，冷卻，析出白色固體，抽濾，水洗，得到白色晶體7.6g。用70%乙醇重結(jié)晶，得到白色粗針狀晶體6.8g，收率83%，m.p.123124，與文獻(xiàn)一致。目標(biāo)系列一化合物(Z)-2-亞胺基-5-(2-氧代取代吲哚-3-亞基)噻唑-4-酮的合成(Z)-2-亞胺基-

39、5-(7-氟-2-氧代吲哚-3-亞基)噻唑-4-酮2.46g(0.03mol)CH3COONa加入20ml冰醋酸，加熱回流至CH3COONa完全溶解，依次加入1.05g(0.009mol)2-亞胺-4-噻唑酮和1.65g(0.01mol)7-氟吲哚-2,3-二酮，繼續(xù)回流5小時，反應(yīng)結(jié)束，停止加熱，冷卻，過濾，濾餅用無水乙醇洗滌，烘干，得桔黃色固體2.23g，產(chǎn)率84.8%，m.p.>300；1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) : 11.62(s, 1H, HN=C), 9.69(s, 1H, H-N-C=O), 9.41(s, 1H, H-N-C=O), 8.83(d,

40、 J=7.7Hz, 1H, Ar-4-H), 7.29(t, J=9.1Hz, 1H, Ar-6-H), 7.06(dd, J=6.6Hz, J=11.7Hz, 1H, Ar-5-H);HRESI-MS m/z: 264.0235 M+H+;Calc Mass for C11H6FN3O2S: 263.0165; found: 263.0162.(Z)-2-亞胺基-5-(7-氟-1-甲基-2-氧代吲哚-3-亞基)噻唑-4-酮0.75g(0.009mol)CH3COONa加入6ml冰醋酸，加熱回流至CH3COONa完全溶解，依次加入0.12g(0.001mol)2-亞胺-4-噻唑酮和0.2g(0

41、.0011mol)7-氟-1-甲基-吲哚-2,3-二酮，繼續(xù)回流5小時，反應(yīng)結(jié)束，停止加熱，冷卻，過濾，濾餅用無水乙醇洗滌，烘干，得深黃色固體0.24g，產(chǎn)率79.1%，m.p.>300；1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) : 11.009.00(bm, 2H, HN=C, H-N-C=O), 8.91(d, J=7.8Hz, 1H, Ar-4-H), 7.29(dd, J=8.4Hz, J=11.6Hz, 1H, Ar-6-H), 7.06(dt, J=11.1Hz, J=5.1Hz, 1H, Ar-5-H); 3.42(s, 3H, -CH3);HRESI-MS m/

42、z: 278.0390 M+H+;Calc Mass for C12H8FN3O2S: 277.0321; found: 277.0317. (Z)-5-(7-氟-2-氧代吲哚-3-亞基)噻唑-2,4-二酮3g(0.037mol)CH3COONa加入24ml冰醋酸，加熱回流至CH3COONa完全溶解，依次加入1.87g(0.016mol) 2,4-噻唑二酮和2g(0.018mol)7-氟吲哚-2,3-二酮，繼續(xù)回流5小時，反應(yīng)結(jié)束，停止加熱，冷卻，過濾，濾餅用無水乙醇洗滌，烘干，得紅色固體2.15g，產(chǎn)率45.3%，m.p.>300；1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) :

43、 12.88(s, 1H, O=C-NH-C=O), 11.75(s, 1H, H-N1-C=O), 8.62(d, J=7.9Hz, 1H, Ar-4-H), 7.35(t, J=8.7Hz, 1H, Ar-6-H), 7.09(dt, J=11.1Hz, J=5.3Hz, 1H, Ar-5-H);HRESI-MS m/z: 262.9928 M-H-;Calc Mass for C11H5FN2O3S: 264.0005; found: 264.0001.(Z)-5-(7-氟-1-甲基-2-氧代吲哚-3-亞基)噻唑-2,4-二酮1.5g(0.037mol)CH3COONa加入12ml冰醋酸

44、，加熱回流至CH3COONa完全溶解，依次加入0.65g(0.0055mol) 2,4-噻唑二酮和1g(0.005mol)7-氟-1-甲基-吲哚-2,3-二酮，繼續(xù)回流5小時，反應(yīng)結(jié)束，停止加熱，冷卻，過濾，濾餅用無水乙醇洗滌，烘干，得棕紅色固體1.08g，產(chǎn)率78.2%，m.p.278280；1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) : 12.90(s, 1H, O=C-NH-C=O), 8.58(t, J=8.0Hz, 1H, Ar-4-H), 7.32(dd, J=8.4Hz, J=11.7Hz, 1H, Ar-6-H), 7.07(dd, J=4.89Hz, J=7.7Hz,

45、 1H, Ar-5-H), 3.35(s, 3H, - CH3); HRESI-MS m/z: 277.0091 M-H-;Calc Mass for C12H7FN2O3S: 278.0161; found: 278.0164.四 總 結(jié) 從我國在上世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的雙吲哚-2-酮類化合物(即靛玉紅、異靛藍(lán)等)，直至近10年大批量的各種吲哚-2-酮衍生物被合成出，吲哚-2-酮衍生物都表現(xiàn)出對CDKs等多種蛋白酪氨酸激酶(PTK)有不同程度上的抑制效果，能較好地滿足CDKs抑制劑結(jié)構(gòu)上的要求，具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，故繼續(xù)開展以吲哚-2-酮為先導(dǎo)物的抗腫瘤藥物研究仍有必要。本文還綜述了多胺結(jié)構(gòu)在

46、抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，即包括多胺在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，細(xì)胞的多胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對具有多胺結(jié)構(gòu)的化合物的識別和轉(zhuǎn)運，多胺類似物和綴合物對腫瘤細(xì)胞選擇性和抗腫瘤作用的增強(qiáng)，以及對細(xì)胞周期的影響等內(nèi)容，為我們本次研究中首次合理地將多胺結(jié)構(gòu)引入到吲哚-2-酮衍生物中提供了支撐。參考文獻(xiàn)：1 a)籍秀娟，吳克美，黃量，等，第十一章 青黛，中草藥現(xiàn)代研究(第一卷)M.北京北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社， 1995:227-257b)吳蓮明，楊光平，朱傳先，等，青黛治療慢性粒細(xì)胞白血病有效成分的研究J.中草藥研究資料,1979,17:1-6c)于邦林，王強(qiáng)，板蘭根、大青葉中靛玉紅、靛蘭的高效液相色譜

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