制半夏抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性及抗腫瘤機理的實驗研究

1、    制半夏抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性及抗腫瘤機理的實驗研究作者：戈宏焱 楊金剛 房學訊 趙樹華 李有田【摘要】  目的研究制半夏對基質(zhì)金屬蛋白酶-16（MMP-16）活性的抑制作用。方法根據(jù)抑制MMPs活性后底物降解速率降低的原理，通過檢測底物降解速率，測定中藥制半夏對MMP-16的抑制作用。結果與空白對照組及陽性對照組相比，制半夏具有較強的抑制MMP-16活性的作用，其抑制活性IC50=23 g/ml。結論半夏水煎劑在體外具有抑制MMP-16活性的作用，其抑制活性較強，且存在劑量依賴關系。 【關鍵詞】  制半夏；

2、 基質(zhì)金屬蛋白酶； 酶活性分析； 抗腫瘤Abstract：ObjectiveTo study the inhibitory action of pinelliae tuber on matrix metalloproteinase-16 (MMP-16).MethodsThe decreasing of the degrade rate of substrate is associated with the inhibition of matrix metalloproteinase-16. We studied the inhibitory activity of pinelliae tub

3、er on MMP by observing the degrade rate of substrate. ResultsPinelliae tuber strongly inhibited the activity of MMP-16, and the IC50 was 23 g/ml.ConclusionThe apozem of pinelliae tuber has inhibitory activity on MMP-16 in a dose-dependent manner in vivo.Key words：Pinelliae tuber; Matrix metalloprote

4、inase; Methods for the analysis of enzymatic activity我國傳統(tǒng)中藥半夏Pinelliae tuber具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效。長期的臨床實踐表明半夏具有確切的療效。半夏生品有小毒，臨床上內(nèi)服必須經(jīng)過炮制或與生姜配伍以減輕毒性，故本實驗所用半夏均為臨床應用廣泛的炮制半夏?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類鋅離子依賴的蛋白水解酶家族，能夠降解細胞外基質(zhì)成分，參與眾多重要的生理和病理過程1。根據(jù)報道, MMPs活性的抑制對腫瘤細胞的行為有重要的影響24。本實驗研究制半夏體外抑制基質(zhì)金屬蛋白酶16活性的作用及抗腫瘤機理，從而為從分子水平上

5、研究半夏的治病機理奠定基礎，也為進一步從半夏中提取基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑提供實驗依據(jù)。 1 器材 1.1 材料制半夏（吉林大學中日聯(lián)誼 醫(yī)院 中藥房提供的道地藥材），自制緩沖溶液（50mmol/L HEPES，0.2M NaCl，10 mmol/L CaCl2，20mol/L ZnSO4，0.05 % Brij-35）,熒光底物DQ-gelatin（美國Sigma公司），已知廣譜MMP的抑制藥物15 nmol/L GM6001。1.2 儀器Bio-Red FLx-800熒光酶標儀(美國), DPX-9082B-1 點熱恒溫培養(yǎng)箱(上海?，攲嶒炘O備有限公司)。 2 原理與方法 2.1 原理實驗所用

6、底物為熒光底物，酶降解底物后發(fā)熒光，通過熒光酶標儀檢測反應體系的熒光強度變化。抑制活性的測定是在反應體系中加入半夏提取物，提取物中抑制成分與酶結合，占據(jù)酶的活性中心，使底物不能與酶結合，從而導致酶降解底物速率降低，熒光強度變化減慢。2.2 方法2.2.1 分組分為空白對照組（反應體系中不加入任何藥物）、陽性對照組（反應體系中加入已知mmp抑制藥物GM6001）、半夏水提物不同濃度組（加入不同濃度半夏水提物）。2.2.2 提取物的制備將3 g半夏放入水中沸水煮3 h，然后過濾得到水煮溶液，將水煮溶液低溫凍干，得到半夏水提取物。配制濃度為0.4，1.2，2，2.8和3.6 mg/ml的水提取物溶液

7、。2.2.3 抑制活性的測定將一定量的MMP-16分別與1 l不同濃度的半夏水提取物（0.4，1.2，2，2.8和3.6 mg/ml）、1 l無菌蒸餾水、1 l 15nmol/L的GM6001加入96孔酶標板中，然后加入緩沖溶液（50mmol/L HEPES， 0.2 M NaCl，10 mmol/L CaCl2，20 mol/L ZnSO4, 0.05% Brij-35），使終體積為50 l，放入37培養(yǎng)箱中孵育30min，然后加入含有0.2 g DQ-gelatin的緩沖溶液50 l，最終反應體系為100 l，制半夏水提取物最終濃度分別為4,12，20，28和36 g/ml，立即用Bio-

8、Red FLx-800熒光酶標儀進行檢測，激發(fā)波長為460 nmol/L發(fā)射波長為520 nM。檢測10 min。檢測的熒光強度變化就代表酶降解底物活力的強弱。2.2.4 抑制活性 計算 Vi代表加入抑制劑組的熒光強度變化，用Vo代表沒有加入抑制劑組的熒光強度變化，抑制劑的抑制百分數(shù)用下邊的公式計算：抑制百分數(shù)（%）=1-Vi/Vo ,當抑制百分數(shù)為50%時，則為此抑制劑抑制酶活性的IC50。 3 結果  圖17分別是空白對照組與半夏水提物濃度分別為4，12，20，28和36 g/ml的實驗組及陽性對照組的測定結果，圖中“Mean V”表示隨時間變化的熒光強度的變化速率，可

9、以作為相對的底物降解速率，根據(jù)實驗方法中所給出的公式，能夠 計算 出不同濃度的半夏提取物對MMP-16的抑制百分數(shù)。通過以上數(shù)據(jù)，能夠推測MMP-16的活性抑制50%時所需要的半夏的量，見圖8，IC50=23 g/ml。圖1 空白對照組（略）圖2 4g·ml-1半夏水提物的測定結果（略）圖3 12g·ml-1半夏水提物的測定結果（略）圖4 20g·ml-1半夏水提物的測定結果（略）圖5 28g·ml-1半夏水提物的測定結果（略）圖6 36g·ml-1半夏水提物的測定結果（略）圖7 陽性對照組的測定結果（略）圖8 不同濃度的制半夏抑制活性的分析（

10、略） 4 討論  MMPs是鋅肽酶家族的一員，是組成結締組織細胞外基質(zhì)降解過程中必不可少的酶，幾乎能降解細胞外基質(zhì)的所有成分,在體內(nèi)多種生理和病理過程中起重要作用5。在創(chuàng)傷愈合、骨質(zhì)再吸收、懷孕和分娩以及乳腺萎縮等與組織重塑有關的生理過程中均有MMPs的參與6，而在類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、角膜潰瘍、牙周疾病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、神經(jīng)退行性疾病如多發(fā)性梗塞等以細胞外基質(zhì)過度破壞為主要特征的病理過程中MMPs亦發(fā)揮重要作用7。MMPs的表達和活化與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關，在惡性腫瘤中MMPs經(jīng)常過度表達8。基于此，MMPs已成為惡性腫瘤 治療 的一個新靶點。 目前

11、幾種廣譜、低分子量的用于數(shù)種類型的腫瘤治療的MMP抑制劑已被臨床評估。雖然這些小分子藥物在臨床前的動物實驗中能高效地抑制MMP的活性并有效地阻止腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，但是其價格昂貴，并且在臨床應用中表現(xiàn)出了強烈的副作用，最終導致后期臨床的失敗9。其原因可能在于這些抑制劑的特異性不強，對于許多其它種類的MMP的正常生理功能也起了不同程度的影響。因此，尋求高效的、特異性強的MMP抑制劑是這個領域當前工作的重點，也是目前國內(nèi)外開發(fā)抗癌藥物的熱點。半夏在我國的臨床應用 歷史 悠久，價廉易得，成分分離工藝簡便，藥效記錄多，安全性和毒副作用有驗證，這些優(yōu)勢是合成化合物所無法比擬的。本實驗表明,制半夏水煎液具有

12、抑制MMP-16活性的作用, 其抑制活性IC50=23g/ml，與空白及陽性對照組抑制活性相比后發(fā)現(xiàn)，在體外半夏抑制MMP-16活性的作用較強，且其抑制強度存在劑量依賴關系，水煎液的濃度越大，抑制作用越強。實驗結果為從分子水平上研究半夏治療相關疾病的機理奠定了基礎，也為今后進一步從半夏中提取基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑并開發(fā)出以MMPs為靶點的中藥新藥提供了理論依據(jù)。 針對MMP-16的抑制效果已經(jīng)完成，針對其他種類的MMPs的抑制效果仍有待進行，我們將以MMPs的抑制活性為指導，繼續(xù)分離、鑒定出半夏中的MMPs抑制成分。【 參考  文獻 】 1 Uta B. Hofmann, R

13、oland Houben, Eva-B,et al. Role of matrix metalloproteinases in melanoma cell invasionJ. Biochimie， 2005,87:307.2 Ming-Chung Jiang, Ching-Fong Liao , Po-Huang Lee. Aspirin Inhibits Matrix Metalloproteinase-2 Activity, Increases E-Cadherin Production, and Inhibits in Vitro Invasion of Tumor CellsJ. B

14、iochemical and Biophysical Research Communications, 2001:282, 671. 3 Ki-Tae Ha, Tae-Kyun Lee, Keum-Hwa Kwak,et al. Inhibitory effect of Cho-Deung-San on human aortic smooth muscle cell migration induced by TNF-a through inhibition of matrix metalloproteinase-2 and -9 activityJ. Vascular Pharmacology

15、，2004,41: 83.4 Risto Ala-aho,Veli-Matti Khri. Collagenases in cancerJ. Biochimie,2005,87: 273.5 陳華江，乇軍杰.基質(zhì)金屬蛋白酶的結構及其調(diào)節(jié)機制J.國外醫(yī)學·腫瘤學分冊，2001，28(1):20.6 Kugler A.Matrix meta11oproteinases and their inhibitorsJ.Anticancer Res1999，19(2):15897 VeliMatti K，Saarialho-kere U. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in tumor growth and invasionJ. An