實驗十pUC57T載體的制備

1、實驗十 pUC57 T 載體的制備一原理PCR 產物的克隆是一種有效的克隆目的基因的方法，但是在實際應用中，由于方法學上 的一些技術問題可能限制其應用。由于PCR產物3'末端突出一個 A,因此克隆PCRT物的載體3'末端必須突出一個 T,這樣載體與PCR產物之間形成粘性長端?，F在許多公司開發(fā) 出了此類專用于 PCR產物克隆的T載體。本實驗中將平端內切酶EcoRv酶解的EcoRv,用Taq酶將其3'末端加上T,然后用T4連接酶將能自身環(huán)化的質粒連接。用凝膠電泳將自身 環(huán)化的質粒與3'末端帶有T.不能自身環(huán)化的線性質粒分開，回收線性質粒片段即為pUC57T 載體。二

2、方法1 .制備pUC57質粒DNA (見實驗一)2 .用EcoR V酶解pUC57 DNA (見實驗九)3 .在酶解的pUC57 DNA末端加上 T。取一支 0.5ml 微離心管.加入：EcoR V 酶解的 pUC57 DNA 10 卩 g10 X PCR緩沖液15卩l(xiāng)dTTP 10mmol/ L20卩 lTaq DNA聚合酶（5U/卩l(xiāng)） 1 卩l(xiāng) ddH?O to150l 10 000r/min 離心 5s 混勻，72C水浴 2h。4. DNA片段的純化(1) 在上述0.5ml微離心管中加入等體積(15卩l(xiāng))酚/氯仿混勻，放置數分鐘，5 000r/min 離心5min.使液體分層。(2)

3、吸收酚/氯仿抽捉提之水相至另一 1.5ml 離心管中，加入 1/10 體積的乙酸鈉，加 2 倍體積冷無水乙醇，混勻。 -20 C冰箱放置2h, 15 000r /min離心15min。(3) 傾去乙醇，加入 70冷乙醇淋洗。(4) 傾去乙醇，濾紙吸干，真空抽吸23min。(5) 加人30卩l(xiāng) ddH 2O,溶解 DNA5. 載體DNA自身連接在DNA片段純化管中，加入 5卩l(xiāng) 10x連接酶緩沖液和2 UT4 DNA連接酶，并用重蒸水補至總 體積50卩l(xiāng)。16C連接16小時。6. 瓊脂糖凝膠電泳將DNA連接液在I % (Wt/ V01)瓊脂糖凝膠上電泳分離 pUC57 T載體和原載體7. pUC

4、57 T載體的純化用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化線性載體，井用電泳對此載體進行定量。110mmol/L dTTP。2. Taq DNA聚合酶，5U/ 卩 l3酚/氯仿。4.乙醇放置-20 C冰箱保存?zhèn)溆谩?乙酸鈉， 670%冷乙醇7 ddH2O。8瓊脂糖。9. T4DNA連接酶。1010X 連接酶緩沖液。11溴酚藍指示劑12. EB溶液13瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒四說明本實驗是一個典型的將具有平齊末端的線性DNA片段變成粘性片段的方法。在基因工程過程中經常要將平齊末端轉變?yōu)檎承阅┒嘶蛞獙⒄承阅┒宿D變?yōu)槠烬R末端，除了本實驗中 的方法外還有下列方法：1 在平齊末端產生新限制性內切酶位點的方法

5、(1) 試劑 T4 DNA連接酶 10xT4 DNA連接酶反應緩沖液300 mmol L Tris-HCI ， pH7.8100 mmol L MgCl 2100 mmol L DTT10 mmol L ATP注：IOX連接酶緩沖液應-20 C保存。不要多次凍存和融化。連接緩沖液中ATP降解連接反應失敗的最常見原因。 磷酸化限制酶接頭 無核酸酶重蒸水 限制性內切酶及其緩沖液 氯仿：異戊醇(24 : 1)TE 緩沖液10 mmoI L Tris HCII mmoI L EDTA酚：氯仿：異戊醇 (25 ： 24： 1)混合等體積的TE緩沖液與重蒸酚，分層后，再將 1份下層酚相與1份氯仿：異戊醇(

6、24 : 1) 混合即可。(2) 原理限制酶接頭是合成的 DNA雙鏈，含有限制性內切酶識別序列，可用于將一個新的限制 性內切酶位點加入到含平端的DNA片段上。商品化的接頭有5'末端磷酸化和非磷酸化兩種。磷酸化的接頭更適于本實驗.因為T4 DNA連接酶需要一個 DNA模板5'末端含磷酸基團。使用磷酸化的接頭可以與非磷酸化的載體連接，這樣可以降低載體自身重新連接的背景。(3) 方法 取一微離心管，分別加入：10 X T4 DNA連接酶反應緩沖液1 卩IDNA(100 500ng)1卩 I磷酸化限制酶接頭超過DNA片段的摩爾數100倍T4 DNA 連接酶 (Weiss 單位 )2.5

7、 u加無核酸酶蒸餾水至I0卩I* 注：1卩g Ikb DNA片段約為1 . 52pmol.商品限制酶接頭常以 A260度量對于10堿基的 限制酶接頭， 0.015A 260 的量相當于大約 152pmol DNA。 15 C反應618小時。 70 C加熱10分鐘終止反應。 立即在冰上冷卻反應管，用相應的限制性內切酶進行酶解， 酶解后，加等體積酚：氯仿：異戊醇 (25 : 24： 1)到反應管中提取 DNA振搖I分鐘， 12 000g 離心 5分鐘。 轉移上層水相至另一新離心管中.為增加回收率，有機相用小量TE緩沖液重提一次。 加等體積氯仿；異戊醇 (2J1 : 1)，振搖30秒，12 OOOg

8、離心2min,移上層水相至另 新管中。 用瓊脂糖凝膠電泳除掉未連接的限制酶接頭片段，從膠中川收DNA片段。2 .將 5'突出末端轉變?yōu)槠蕉说姆椒?1) 試劑 ' 無核酸酶重蒸水 限制性內切酶及其緩沖液 氯仿：異戊醇(2 /1: 1) TE緩沖液10 mmoI L Tris-HCII mmoIL EDTA 酚：氯仿；異戊醉(24:1) 3mol / L乙酸鈉，pH5. 2 無水乙醇 70%乙醇 DNA聚合酶大片段(Kle now) 10XDNA聚合酶Klenow片段緩沖液500 mmol L Tris HCl, pH7. 2100 mmol L MgSO4l mmol/L DTF

9、(11) T4 DNA聚合酶(12) 10 x T4 DNA聚合酶緩沖液330 mmol L Tris 乙酸 pH 7.9660 mmol L 乙酸鉀100 mmol / L乙酸鎂5 mmol L DDT(13) 乙?；Ｑ灏椎鞍?，1 mg / ml(14) dNTPs 100 mmol / L(2) 原理Klenow(DNA聚合酶大片段)及T4 DNA聚合酶都能利用 dNTPs補齊5'突出末端(3) Klenow 聚合酶法 酶解DNA形成5'突出末端。 加等體積酚：氯仿：異戊醇 (25 : 24： 1)到反應管中提取 DNA振搖1分鐘，12 000g 離心 5分鐘。 轉移上

10、層水相至另一新離心管中，為增加回收率，有機相用小量TE緩沖液重提一次。 加0.1體積3mol/L乙酸鈉和2體積無水乙醇，冰上或-20 C放置1530分鐘，沉淀DNA。 4 C 12 OOOg離心10分鐘.如果 DNA濃度較低，小于 100ng/m1,離心時間為 30分鐘 這樣可增加DNA勺回收率。注：小量DNA勺回收也可通過加入核酸如酵母DNA到樣品中，使其終濃度達50卩g/ml,而改進回收效果。如果 tRNA會影響以后DNA勺應用，也可使用糖原。 離心棄上清.加 200卩I 70 %乙醇。12 OOOg 4 C離心5分鐘。 小心移去上清，空氣中干燥沉淀。 用含：40卩mol/L每種dNTP及

11、0.1mg/ml乙?；Ｑ灏椎暗腎倍Klenow酶緩沖液 溶解DNA每微克 DNA加入1u lqenowDNA聚合酶。總反應體積在 10 一 100之間均可。Klcnow DNA 聚合酶在許多限制酶反應緩沖液中(如Promemt的核心緩沖液)有一定活性。這樣可直接將酶及 40卩mol/L每種dNTP加入到限制酶反應后的反應管中，省略以上的 步。將反應管置室溫中反應 10分鐘 75 C作用10分鐘終止反應。T4DNA聚合酶法 采用 Klenow 聚合酶法的一步驟純化DNA。 用含100卩mol/ L每種dNTP和0.1mg/ml乙?；Ｑ灏椎鞍椎?倍T4DNA聚合酶反應緩沖液溶解DNA每微克

12、DNA加5u T4DNA聚合酶 75 C作用10分鐘終止反應。3 .將3'突出末端轉變?yōu)槠蕉说姆椒?1) 試劑 無核酸酶重蒸水 限制性內切酶及其緩沖液 氯仿：異戊醇(24 : 1) TE緩沖液lO mmol /L Tris HCIl mmol /L EDTA 酚：氯仿：異戊醇(25:24:1) 3mol/ L乙酸鈉，pH5. 2 無水乙醇 70%乙醇 T4 DNA聚合酶 10 x T4 DNA 聚合酶緩沖液330 mmol /L Tris 乙酸， pH 7. 9660 mmol / L 乙酸鉀100mmol /L 乙酸鎂1 mmol /L DTT(11) 乙酰化牛血清白蛋白(12) d

13、NTPs 100 mmol / L(2) 原理在過量dNTP存在下T4 DNA聚合酶具有3' 一 5,核酸外切酶活性，能將3,突出末端轉變?yōu)?平齊末端。(3) 方法 酶解DNA形成3'突出末端。 加等體積酚：氯仿：異戊醇 (25 : 24： 1)到反應管中提取 DNA振搖1分鐘，12 000g離心5 分鐘。 轉移上層水相至另一新離心管中，為增加回收率，有機相用小量TE緩沖液重提一次。 加0體積3mol / L乙酸鈉和2體積無水乙醇，冰上或 -20 C放置1530分鐘，沉淀 DNA。 4 C 12 000g離心10分鐘，如果 DNA濃度較低，小于100ng/ml，離心時間為 30

14、分鐘， 這樣可增加DNA的回收率。注：小量DNA的回收也可通過加入核酸如酵母DNA到樣品中，使其終濃度達 50卩g/ ml而改進回收效果。如果tRNA會影響以后DNA的應用，也可使用糖原。 離心棄上清，加 200卩l(xiāng) 70 %乙醇，12 000g 4 C離心5分鐘。 小心移去上清，空氣中干燥沉淀。 用含100卩mol/ L,每種dNTP及0.1mg/ ml乙?；Ｑ灏椎鞍椎?倍T4DNA聚合酶緩沖液溶解DNA 0.25卩gDNA的反應體積為 20卩l(xiāng)，每微克DNA加5u T4DNA聚合酶。37C反應5分鐘。注：高濃度的dNTPs(100卩mol/ L)將使DNA的降解終止在雙鏈 DNA處，。然而，如果 dNTPs含量太低，TIDNA聚合酶的外切酶活性則很高.可使雙鏈 DNA降解。在本反應中，所 有4種dNTP都必須有。 75C作用10分鐘，終止反應：4. 部分補齊 5，突出末端的方法對上