組合生物合成技術(shù)在聚酮類天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用

1、28MOTOLAS,MOGAVEROA,AGESIMGR,etal1OrallyAdministrableIbuprofenCompositionsP1Can1Pat1Appl1CA1336819,1995208229129GRUBERP1Easytoswalloworalmedicamentcomposition:USPatent6,709,678P12004203223130SHONGYM,PINGQN1Developingtramadolresinfast2releasesuspen2sionJ1ChinPharmUnivJ(中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)),2000,31(1):21131AGARW

2、ALR,MITTALR,SINGHA1StudiesofionexchangeresincomplexofchloroquinephosphateJ1DrugDevIndPharm,2000,26(7):7732776132GAOR,SHAOZJ,FANACL,etal1TasteMaskingofOralQuinoloneLiquidPreparationsUsingIonExchangeResins:USPatent,6,514,492P12003202204133RYUS1GranulerDrugCompositionforAnimal:JP03,101,619P.19912042201

3、34ROCKAWAYNJ,FLEMINGTONNJ,NEWTONNJ,etal1Multipleactioncold/sinuspreparations:USPatent,5,681,577P11997210228135HOUSG,WANGPY1Thepreparationofinclusioncompoundofraniti2dine22cyclodextrinJ1ChinPharmJ(中國(guó)藥學(xué)雜志),1996,31(8):480136HUSSAINMA,AUNGSTBJ,KOVALCA,etal1Improvedbuccalde2liveryofopioidanalgesicsandant

4、agonistswithbitterlessprodrugsJ1PharmRes,1988,5:6152618137LIUXY,LIUYQ1Studyofamaskingmethodtodispelthebitternessofmacrolide2antibioticsanditsapplicationtoprescriptionsJ1PekingUnivJ(HealthSciences)(北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)),1997,29(3):136138KINOSHITAY,SHIBUYAM1PreparationCompositionforSuppressingBitterness:JP,62,265

5、,234P11987211211139KASTURAGIY,KURIHARAK1SpecificinvitrobittertasteJ1Na2ture,1993,365(6443):2132214140DUONGHT,GUHHY,KOCY,etal1AHPLCassayforcoatingin2tegrityoftopiramatesprinkleformulationJ1JPharmBiomedAnal,2002,29(122):69274141SALAZARDE,SAAVEDRAM,SAAVEDRAC1Applicationofasenso2rialresponsemodeltothede

6、signofanoralliquidpharmaceuticaldosageformJ1DrugDevIndPharm,2000,26(1):55260142NAKAMURAT,TANIGAKEA,MIYANAGAY,etal1Theeffectofvarioussubstancesonthesuppressionofthebitternessofquininehumangustatorysensation,binding,andtastesensorstudiesJ1ChemPharmBull(Tokyo),2002,50(12):1589215931(收稿日期:2005207225)趙文英

7、1,2,顧謙群13,朱偉明1(11,山東青島266003;21青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東青島,266042)摘要:目的,展望該技術(shù)的廣闊應(yīng)用前景。方法檢索近幾年的文獻(xiàn)資料進(jìn)行分析歸納。組合生物合成技術(shù)對(duì)先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)改造和合成非天然的“天然產(chǎn)物”具有重要意義。關(guān)鍵詞:組合生物合成;聚酮類;天然產(chǎn)物中圖分類號(hào):R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1001-2494(2006)19-1448-05抗生素耐藥性及化療藥物毒副作用的存在,促使人們不斷發(fā)現(xiàn)新的抗生素類藥物。但從天然產(chǎn)物中尋找活性強(qiáng)、毒性低的抗生素變得越來(lái)越困難。因此,科學(xué)家求助組合生物合成技術(shù)合成新的“天然產(chǎn)物”用于新藥的發(fā)現(xiàn)。組合生物合成

8、技術(shù)通過(guò)對(duì)抗生素或其他“天然產(chǎn)物”生物合成途徑中的合成酶基因的操縱,實(shí)現(xiàn)對(duì)先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)改造和合成非天然的“天然產(chǎn)物”。在天然產(chǎn)物尤其是聚酮類化合物(polyketides,PKs)生物合成的研究中,組合生物合成技術(shù)大有生物化學(xué)和分子遺傳學(xué)研究表明,聚酮生物合成途徑中的聚酮合酶(polyketidesynthases,PKSs)與合成長(zhǎng)鏈脂肪酸的脂肪酸聚合酶(FASs)在結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制上具有相似性5。它們都是多功能酶,催化?；蝓タs合,生成各種長(zhǎng)度的碳鏈。不同在于脂肪酸的2C會(huì)發(fā)生完全的還原,而聚酮合成可以省略某些或全部縮合后反應(yīng)。聚酮合酶由于所選擇的起始單元和延伸單元的不同,縮和后對(duì)2C的修

9、飾程度不同以及手性碳的立體化學(xué)和環(huán)化的部位專一性不同使聚酮化合物具有結(jié)構(gòu)多樣性的特征。近年研究還發(fā)現(xiàn),聚酮合酶基因組非常保守,不同聚酮合酶的DNA序列間有很大的相似性。因此,通過(guò)合理設(shè)計(jì)聚酮合酶有可能產(chǎn)生出新的聚酮化合物,這也是科學(xué)家對(duì)聚酮生物合成感興趣的原因。2聚酮生物合成酶的特點(diǎn)作為122。聚酮化合物在次級(jí)代謝產(chǎn)物中是最大的一類,包括大環(huán)內(nèi)酯、四環(huán)類、蒽醌類和聚醚類在內(nèi)的許多化合物均屬于這個(gè)大家庭。由于這些化合物在抗感染、抗腫瘤、抗真菌、免疫抑制等方面的巨大應(yīng)用價(jià)值,因此,吸引了各國(guó)科學(xué)家對(duì)該類化合物生物合成途徑進(jìn)行深入的研究,以期獲得利用基因工程方法改造和合成聚酮化合物的資料325。1聚

10、酮類化合物生物合成的特點(diǎn)隨著生物技術(shù)的發(fā)展,大量聚酮合成酶的基因被克隆,研究結(jié)果顯示,聚酮合成主要由兩類酶催化,分為和型。2.1型聚酮合成酶的作用基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No130472136&30470196);國(guó)家863項(xiàng)目基金(No12003AA624020)作者簡(jiǎn)介:趙文英,女,博士研究生3通訊作者:顧謙群,女,教授,博士生導(dǎo)師Tel:(0532)82032065E2mail:guqiangqChinPharmJ,2006October,Vol141No1191448中國(guó)藥學(xué)雜志2006年10月第41卷第19期型PKSs是大分子多功能蛋白(Mr>150000)

11、,主要催化合成復(fù)雜的聚酮化合物,包括大環(huán)內(nèi)酯類、利福霉素類(含內(nèi)酯、內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu))、多烯類、聚醚類等。它的結(jié)構(gòu)類似一條裝配流水線“,裝配線”上的酶是按“組塊”的形式組合在一起,每一組塊催化聚酮鏈延長(zhǎng)一個(gè)單位,因此型PKSs又稱為組合式PKS。每一個(gè)組塊又可再細(xì)分為單一“結(jié)構(gòu)域”,每一結(jié)構(gòu)域有一種功能,可催化縮合或還原反應(yīng)。即功能性結(jié)構(gòu)域組成了組塊,組塊連接在一起組成酶,酶作為一個(gè)模板用來(lái)負(fù)載和縮合單體,組塊或結(jié)構(gòu)域與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)之間存在著一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系,見(jiàn)圖13,629。因此,了解組塊和結(jié)構(gòu)域的DNA序列,可以從已知天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)推測(cè)出“裝配線”的組acids,teracenanycins等,這些化

12、合物在結(jié)構(gòu)上雖然有很大的區(qū)別,但它們都是由型PKSs催化生成的。與型PKSs不同之處在于,型PKSs是1個(gè)多酶復(fù)合物,見(jiàn)圖25,12214,每個(gè)PKS都含有一組重復(fù)使用的獨(dú)立蛋白,也稱作minimalPKS,它包括KS,AT,CLF,ACP3個(gè)亞基(其中KS,AT在同一亞基上),這是聚酮合成所必需的,用于構(gòu)建1個(gè)未經(jīng)修飾的聚酮鏈(高度活潑的線性聚酮2酮?；蝓?。另外每個(gè)PKS還有幾個(gè)大的多功能蛋白,用于還原(酮基還原酶KR催化)和環(huán)化(環(huán)化酶CYCT和芳香酶ARO催化)新生成的聚酮鏈。因?yàn)槊總€(gè)型PKSs只含有1組mininalPKS及少量修飾酶,每個(gè)催化亞基是重復(fù)使用的。因此,從型PKSs的

13、DNA序列推測(cè)出芳香聚酮的結(jié)構(gòu)非常困難,也不能直接設(shè)計(jì)芳香聚酮的分子結(jié)構(gòu)。盡管存在著這樣的困難,近幾年在合理設(shè)計(jì)芳香聚酮化合物方面,還是取得了巨大的進(jìn)步。通過(guò)重組芳香PKSs,把活性亞基與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)起來(lái),提出以預(yù)測(cè)方10,15218式生產(chǎn)芳香聚酮化合物的“設(shè)計(jì)規(guī)則”。根據(jù)“設(shè)計(jì)規(guī)成,反之亦然。這種組塊的組合方式也使人們嘗試構(gòu)建非天然合成酶,用于合成一些新的化合物10211。2.2型聚酮合成酶的作用型PKSs主要是催化合成芳香聚酮化物,因此又稱芳香PKSs。目前已發(fā)現(xiàn)的多環(huán)芳香聚酮化合物有500多個(gè),它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上主要屬于四環(huán)類,angucyclines,蒽環(huán)類,aureolic則”,可以設(shè)計(jì)出

14、所需要的聚酮化合物15,19222。圖1型PKSs的結(jié)構(gòu)62dEB聚合酶由DEBS1,2和3組成,每個(gè)DEBS由兩個(gè)組塊組成,每個(gè)組塊包含有催化縮合的活性亞基;?；D(zhuǎn)移酶(AT),2酮?；d體蛋白合成酶(KS)和?；d2酮基還原酶(KR),脫水酶(DH)和烯酰還原酶(ER)。反應(yīng)完成后,硫酯酶(TE)負(fù)責(zé)聚酮鏈從酶上解離體蛋白(ACP),同時(shí)有還原性活性亞基Fig1ModularpolyketidesynthasesDEBSpolyketidesynthaseassemblyincludesthethreemultifunctionalproteinsDEBS1,2and3,eachofwhi

15、chcomprisestwomodules1Eachmodulecontainsafullcomplementofsitesrequiredforonecondensation,anacyltransferase(AT),2ketoacylcarrierproteinsynthase(KS)andanacylcarrierprotein(ACP),alongwithasubsetofreductiveactivesites2ketoreductases(KR),dehydratase(DH)andenoylreductase(ER)1Afterthefinalcondensationandre

16、duction,thethioesterase(AT)cleavesthepolyketidechainfromtheenzyme圖2型PKSs的結(jié)構(gòu)minimalPKS包括酮基合成酶(KS),?；d體蛋白(ACP),鏈長(zhǎng)因子(CLF),?；D(zhuǎn)移酶(AT),酮基還原酶(KR),芳香化酶(ARO),環(huán)化酶(CYC)Fig2Aromaticpolyketidesynthases2ketoacylsynthase(KS),achainlengthfactor(CLF),anacylcarrierprotein(ACP)andanacyltransferase(AT);ketoreductases(K

17、R);aromatases(ARO);minimalPKSincludingacyclases(CYC)3應(yīng)用組合生物合成方法生成新的聚酮化合物然產(chǎn)物。常用的方法主要包括以下兩種。3.1定點(diǎn)突變由于PKSs結(jié)構(gòu)和功能上特點(diǎn),研究人員嘗試把聚酮生物合成途徑中的催化酶進(jìn)行不同方式的組合,以獲得新的天中國(guó)藥學(xué)雜志2006年10月第41卷第19期定點(diǎn)突變即采用失活、取代等方法,對(duì)PKSs中的單一結(jié)ChinPharmJ,2006October,Vol141No1191449構(gòu)域進(jìn)行修飾。實(shí)驗(yàn)證明,組合式PKSs對(duì)非天然PKSs底物專一性松弛23,下游活性位點(diǎn)對(duì)不正常的聚酮中間體有一定的容忍性,人工設(shè)計(jì)的

18、組塊能最大限度的保持其結(jié)構(gòu)完整性。如對(duì)紅霉素產(chǎn)生菌糖多孢紅霉菌(Saccharopolysporaery2thraea)DEBS基因的組塊5的酮基還原酶結(jié)構(gòu)域的缺失誘變不同來(lái)源的組塊合理設(shè)計(jì),形成雜合PKSs,合成出新的大環(huán)聚酮類化合物,活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),這些新的化合物均有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。Rowe等31在DEBS中插入了一個(gè)生產(chǎn)雷帕霉素的PKSs中的一個(gè)組塊,最終生成了一個(gè)新的碳鏈延長(zhǎng)的八聚酮類化合物。Laine等32將Streptomycesgalilaens菌株中生成多柔比星的基因與來(lái)自同一屬的S1nogalater和S1pur2purascens的基因組合在一起,新生成的化合物中,S251

19、3,產(chǎn)生了可預(yù)見(jiàn)到的52氧262脫氧紅霉內(nèi)酯;用外源性?；D(zhuǎn)移酶取代組塊6中的?；D(zhuǎn)移酶導(dǎo)致期望的22去甲基262脫氧紅霉內(nèi)酯的產(chǎn)生;另外,在一個(gè)或多個(gè)碳中心同時(shí)引入多點(diǎn)突變,也能產(chǎn)生新的大環(huán)內(nèi)酯24。Mendes等25將抗真菌抗生素pimaricin生物合成途徑中的PimD基因敲掉,使pimaricin4,5位的環(huán)氧變成雙鍵,雖然其抗真菌活性有所降低,但對(duì)酸S2526,S25123個(gè)化合物在體外有細(xì)胞毒活性,其中S2512在體外對(duì)所有的細(xì)胞系都有顯著的活性。S2513在體內(nèi)對(duì)小鼠白血病和實(shí)體瘤有活性。Tang等33利用雜合的雙組塊PKSs合成新的芳香聚酮,同時(shí)通過(guò)干擾下游輔助酶或加入非天然氨

20、基酸的方法合成了一系列有生物活性的anthraquinone類似物。另外,生成的聚酮化合物還可以通過(guò)“post2PKS”酶,如糖苷化酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、?；D(zhuǎn)移酶和氧化酶等修飾,進(jìn)一步增加結(jié)構(gòu)多樣性。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)有活性的化合物都是在苷元上連有不同的糖,而聚酮類抗生素生物合成途徑中的糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)底物專一性松弛34236,還可以用基因工程的Streptomycesvenezulackdes基因組引strM基因,能生成一個(gè)連有L2鼠李糖的新的大環(huán)內(nèi)酯化合物38。Wohlert等39將攜帶有elloramycin基因串的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移入生成urdamycin、oleandomycin和mithramycin

21、的菌株中,生成新的糖苷衍生物:它們的苷元都是由elloramycin基因生成的,糖部分由母體菌株生成。Trefzer等40用lan2domycin生物合成途徑中的糖基轉(zhuǎn)移酶(lanGT1和lanGT4)在Streptomycesfradias突變株中生成幾種新的urdamycin衍生物,堿穩(wěn)定性升高,毒性下降?？拱┧幬颿hramumycinA3是一種芳香聚酮,Menéndez等26通過(guò)干擾其生物合成途徑中負(fù)責(zé)編碼側(cè)鏈還原反應(yīng)的聚酮還原酶CmmWI基因,生成3個(gè)新的chramumycin衍生物,它們的抗腫瘤活性因側(cè)鏈不同而有所差別。張部昌等27在糖多孢紅霉菌染色體上敲掉了紅霉素合成基因

22、中的KR6區(qū)域,構(gòu)建了糖多孢紅霉菌M,該菌株可合成自然界中從未發(fā)現(xiàn)的酮內(nèi)酯類化合物:32脫氧232羰基2紅霉內(nèi)酯B。張曉琳28對(duì)阿維鏈霉菌中的產(chǎn)高毒性寡霉素的基因簇(olmA)進(jìn)行了缺失處理,所得突變株不再產(chǎn)生寡霉素而僅產(chǎn)阿維菌素B組分,該突變株性狀穩(wěn)定,有應(yīng)用價(jià)值。另外,物類似物。KinoshitaDEPKSs,類似物。這些結(jié)果表明,產(chǎn)物的類似物方面擁有巨大的潛力,同時(shí)也說(shuō)明在組合式PKSs的還原部位實(shí)行“功能獲得”突變的可行性。但在實(shí)際生產(chǎn)中,大多數(shù)情況下,蛋白質(zhì)的突變會(huì)導(dǎo)致在體內(nèi)“生產(chǎn)率”的降低,因此又提出另一種組合生物合成方法。3.2構(gòu)建雜合PKSs他們是landomycin和urda

23、mycin雜和的寡糖抗生素。綜上所述,這種組合生物合成的方法對(duì)有潛在藥理活性的化合物具有重要的意義。首先,可以提高產(chǎn)率低的化合物的分子產(chǎn)量,增加組合生物合成方法的文庫(kù)容量。其次,提供了1個(gè)生成結(jié)構(gòu)類似的雜合聚酮的有效途徑。如142和162元大環(huán)內(nèi)酯抗生素(erythromycin,picromycin和tylosin),聚這種方法基于催化合成相似結(jié)構(gòu)化合物的PKSs的基因序列相似,而且他們催化生成的中間體也相似,因此一種PKSs的組塊很有可能識(shí)別和有效催化其他結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物的中間體,這樣PKSs中的某一亞基可以用其他來(lái)源的PKSs亞基代替。把不同來(lái)源的組塊或蛋白質(zhì)亞基組合在一起,形成雜合PKS

24、s,可以保持天然蛋白亞基的保守序列,減少定點(diǎn)突變引起的結(jié)構(gòu)缺陷,與前一種方法相比,可以獲得高產(chǎn)率的“非天然”大環(huán)內(nèi)酯類化合物?，F(xiàn)在,利用基因工程可獲得許多不同來(lái)源的PKSs的組塊和亞基,而取代功能組塊的試驗(yàn)已經(jīng)證明,單獨(dú)1個(gè)或一組組塊也能作為操縱功能單元用以構(gòu)建雜合聚酮化合物。如DEBS由3個(gè)多功能蛋白6個(gè)組塊組成,如果把DEBS1與硫酯酶(thioesterase,TE,作用是催化聚酮鏈環(huán)化成內(nèi)酯)結(jié)構(gòu)域連在一起,會(huì)產(chǎn)生1個(gè)三酮內(nèi)酯8,說(shuō)明DEBS1+TE能識(shí)別一系列非天然的起始單元和相關(guān)的中間體并把它們轉(zhuǎn)化為三酮化合物。同樣,把組塊6下游的ACP2TE雙功能域結(jié)合到組塊5上,會(huì)產(chǎn)生一個(gè)12

25、元的內(nèi)酯酮7。Yoon等30將PikPKSs,TylPKSs,DEBSPKSs3種ChinPharmJ,2006October,Vol141No1191450酮類免疫抑制劑(FK506,FK520和rapamycin)等。4結(jié)論作為一個(gè)酶系,PKSs證明自然界可以通過(guò)搭建積木的方式生成有機(jī)分子,產(chǎn)生分子多樣性。和催化復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的多酶體系不同(它們的多樣性緣于組塊模板的多樣性),PKSs體系的蛋白質(zhì)催化劑本身就是以組塊的形式存在,這種在酶水平所固有的組塊化可以通過(guò)組合生物合成來(lái)開(kāi)發(fā)。在最近五年,用PKSs組合生物合成生產(chǎn)新的化合物已從起步階段成為有經(jīng)驗(yàn)科學(xué)家的一項(xiàng)日常工作?，F(xiàn)在已有200多

26、個(gè)新的聚酮化合物,這些化合物大部分很難或不可能通過(guò)目前常用的方法獲得,這證明組合生物合成是一個(gè)很有前途的技術(shù),它提供了一個(gè)發(fā)現(xiàn)新化合物和結(jié)構(gòu)修飾的方法。而Yadav等41又引入計(jì)算機(jī)輔助預(yù)測(cè)功能域組成和組塊的底物專一性,并建成了一個(gè)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù),可用來(lái)鑒定由非特中國(guó)藥學(xué)雜志2006年10月第41卷第19期征性PKSs生物合成的聚酮產(chǎn)品,大大加快了用合理設(shè)計(jì)方法合成新的聚酮化合物的步伐。目前,隨著對(duì)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制和分子特征之間關(guān)系的進(jìn)一步了解,國(guó)內(nèi)外許多研究院、所正投入大量人力、物力致力于用組合生物合成的方法生產(chǎn)出自然界不常見(jiàn)的新的天然化合物。REFERENCES1FLOSSHG.Combina

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34、ides:actandactgenesencodearomataseandcyclaseenzymes,respectivelyJ.JAmChemSoc,1994,116:10855210859.17FUH,EBERT2KHOSLAS,HOPWOODDA,etal.Engineeredbiosynthesisofnovelpolyketides:dissectionofthecatalyticspecificityoftheactketoreductaseJ.JAmChemSoc,1994,116:416624170.18SHENB,SUMMERSRG,WENDT2PIENKOWSKIE,et

35、al.TheStreptomycesglancescenstcmKLpolyketidesynthaseandtcmNpolyketidecyclasegenesgovernthesizeandshapeofaromaticpolyketidesJ.JAmChemSoc,1995,117:681126821.19MCDANIELR,HUTCHINSONCR,KHOSLAC,etal.Engineeredbiosynthesisofnovelpolyketides:analysisofTcmNfunctionintetra2cenomycinbiosynthesisJ.JAmChemSoc,19

36、95,117:680526810.20KRAMERPJ,ZAWADARJX,MCDANIELR,etal.Rationalde2signandengineeredbiosynthesisofanovel182carbonaromaticpolyke2tideJ.JAmChemSoc,1997,119(4):6352639.21BRNKERP,MCKINNEYK,STERNERO,etal.Isolationandchar2acterizationofthenaphthocyclinonegeneclusterfromStreptomycesare2naeDSM40737andheterolog

37、ousexpressionofthepolyketidesynthasegenesJ.Gene,1999,227:1252135.22APARICIOJF,FOUCESR,MENDESMV,etal.Acomplexmul2tienzymesystemencodedbyfivepolyketidesunthasegenesisinvolvedinthebiosynthesisofthe262memberedpolyenemacrolidepimaricininStreptomycesnatalensisJ.ChemBiol,2000,7(11):8952905.23PIEPERR,LUOGL,

38、CANEDE,etal.Remarkablybroadsubstratespecificityofamodularpolyketidesynthaseinacell2freesystemJ.JAmChemSoc,1995,117:11373211374.24TANGL,FUH,MCDANIELR.Formationoffunctionalheterologouscomplexesusingsubunitsfromthepicromycin,erythromycinandolean2domycinpolyketidesynthasesJ.ChemBiol,2000,7:77284.25MENDE

39、SMV,RECIOE,FOUCESP,etal.Engineeredbiosynthesisofnovelpolyenes:apimaricinderivativeproducedbytargetedgenedis2ruptioninStreptomycesnatalensisJ.ChemBiol,2001,8:6352644.26MENNDEZN,NUR2E2ALAMM,BRANA AF,etal.BiosynthesisoftheantitumorchromomycinA3inStreptomycesgriseus:analysisofthegeneclusterandrationalde

40、signofovelchromomycinanalogsJ.Chem,2004,11:21232.27ZHANGC,HG,etal.ConstructionofSac2novelketolide32deoxy232oxo2BJBiotechnol,2002,18(2):1982203.28L.Geneticmanipulationofpolyketidesynthasegenesinstreptomycesavermitilis(阿維鏈霉菌中聚酮合酶基因的遺傳改造)D.Beijing:ChinaAgriculturalUniversity,2004.29KINOSHITAK,PFEIFERBA

41、,KHOSLAC,etal.Precursorr2direct2edpolyketidebiosynthesisinEscherichiacoliJ.Bioorganic&Medici2nalChemLett,2003,13:370123704.30YOONYJ,BECKBJ,KIMBS,etal.Generationofmultiplebioac2tivemacrolidesbyhybridmodularpolyketidesynthasesinStreptomycesvenezuelaeJ.ChemBiol,2002,9:2032214.31ROWECJ,B;HMIU,THOMAS

42、IP,etal.Engineeringapolyke2tidewithalongerchainbyinsertionofanextramoduleintotheery2thromycin2producingpolyketidesynthaseJ.ChemBiol,2001,89:1211.32LAINEA,HALOL,RTYK,etal.Generationofnovelaclacino2mycinanaloguesbycombinatorialbiosynthesistoimproveantitumourpropertiesJ.PoaterSessions,11(22):S117.33TAN

43、GY,LEETS,LEEHY,etal.Exploringthebiosyntheticpo2tentialofbimodulararomaticpolyketidesynthasesJ.Tetrahedron,2004,60:765927671.34BLANCOG,PATALLOEP,BRANA AF,etal.IdentificationofasugarflexibleglycosyltransferasefromStreptomycesolivaceus,thepro2duceroftheantitumorpolyketideelloramycinJ.ChemBiol,2001,8:25

44、32263.35ZHAOLS,AHLERTJ,XUEYQ,etal.Engineeringamethymycin/pikromycin2calicheamicinhybrid:constructionoftwonewmacrolidescar2ryingadesignedsugarmoietyJ.JAmChemSoc,1999,121:988129882.36ZHAOLS,SHERMANDH,LIUHW.Biosynthesisofdesosamine:con2structionofanewmethymycin/neomethyminanaloguebydeletionofadesosamin

45、ebiosyntheticgeneJ.JAmChemSoc,1998,120:10256210257.37HOFFMERSTERD,WILKINSONB,FOSTERG,etal.Engineeredur2damycinglycosyltransferasesarebroadenedandalteredinsubstratespeci2ficityJ.ChemBiol,2002,9:2872295.38YAMASEH,ZHAOLS,LIUHW.Engineeringahybridsugarbiosyn2theticpathway:productionofL2rhamnoseanditsimpl

46、icationondihy2drostreptosebiosynthesisJ.JAmChemSoc,2000,122:12397212398.中國(guó)藥學(xué)雜志2006年10月第41卷第19期(下轉(zhuǎn)第1471頁(yè))ChinPharmJ,2006October,Vol141No1191451心肌細(xì)胞排列緊密,橫紋清晰,核居中,間質(zhì)可見(jiàn)血管擴(kuò)張,未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)心肌間質(zhì)水腫,無(wú)出血。21312電鏡觀察結(jié)果假手術(shù)組心肌細(xì)胞膜完整,線粒體膜完整,嵴致密,基質(zhì)顆粒均勻(圖1A)。溶劑對(duì)照組細(xì)胞水腫,部分心肌細(xì)胞膜局部破裂;線粒體分布紊亂、腫脹,外膜破損,嵴減少、排列紊亂、模糊不清、甚至斷裂消失,基質(zhì)減少,線

47、粒體內(nèi)大片空化(圖1B)。冠心丹參片100mgkg-1組心肌線粒體改變明顯輕于溶劑對(duì)照組,心肌細(xì)胞膜無(wú)破裂,肌原纖維完整有序;線粒膜完整,嵴致密,基質(zhì)密度變淡,局部出現(xiàn)空化區(qū)域(圖1C)。冠心丹參片200mgkg-1組心肌細(xì)胞膜無(wú)破裂,肌原纖維完整有序;線粒體體膜完整,嵴致密,基質(zhì)顆粒均勻(圖1D)。脈流量,改善微循環(huán),抑制血小板聚集,抗心律失常和抗血栓形成等。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠冠心丹參片灌胃抗心肌缺血再灌注損傷作用,提示冠心丹參片不僅可用于治療和預(yù)防心絞痛,對(duì)于預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷也有積極的治療價(jià)值。目前認(rèn)為,心肌缺血再灌注過(guò)程中,再灌注對(duì)心肌的損傷比缺血期更為嚴(yán)重,這種損傷主要與心肌細(xì)

48、胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)4。有研究表明,丹參阻止Ca2+內(nèi)流,減輕Ca2+超載,減少ATP的分解,能夠減少缺血心室肌細(xì)胞APD不均一性以及緩解此時(shí)出現(xiàn)的Ca2+超載現(xiàn)象,因而可能減少因折返或自律性增高所導(dǎo)致的心律失常的發(fā)生5。丹參具有ATP敏感鉀通道的開(kāi)放作用,但丹參是否具有開(kāi)放線粒體或肌漿膜的ATP敏感鉀通道作用尚待證實(shí)。目前線粒體可能成為保護(hù)心肌的藥理學(xué)重要靶位2,冠心丹參片kg-,嵴。但該。本實(shí)驗(yàn)中大鼠冠心丹參片給藥后MBP輕度降低可能與三七皂苷擴(kuò)張外周血管,降低動(dòng)脈血壓有關(guān),但降低血壓一方面可降低心臟負(fù)荷,另一方面降壓反射性引起交感興奮,加上丹參本身通過(guò)抑制心肌細(xì)胞Na+,K+2ATP酶可能使心收縮力增強(qiáng),心率加快,使心氧耗增加,這對(duì)冠心病病人不利,因此該方劑尚待進(jìn)一步完善。REFERENCES1Ch1P(2000)Vol(中國(guó)藥典2000年版1一部)S12000:5712SATOT,SASAKIN,SEHARASEYONJ,etal1Selectivepharma2cologicalagentsimplicatemitochondrialbutnotsarcolemmalKATPchannelsinischim