法分析施肥對番茄青枯病抑制和 土壤健康恢復(fù)的效果 蔡燕飛,廖

1、FAME 法分析施肥對番茄青枯病抑制和土壤健康恢復(fù)的效果蔡燕飛,廖宗文(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,廣州510642摘要:施用生物有機肥(BOF 對連作土壤番茄青枯病發(fā)生率和土壤微生物群落的影響結(jié)果表明,在對照番茄青枯病發(fā)生率為100%的情況下,施用腐熟BOF 對番茄青枯病的防治效果為55%。施用新鮮BOF 對番茄青枯病的防治效果為50%。FAME 法分析發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落對生物有機肥的施用敏感,施用BOF 能提高土壤微生物總FAME 含量、真菌數(shù)量、真菌/細菌比值,使奇數(shù)脂肪酸組成比例發(fā)生明顯變化,aC15:0、iC17:0下降,而cyC17:0上升。施用BOF 使土壤防病能力和健康水平提高。

2、腐熟BOF 處理后土壤微生物群落中C16:111c 含量明顯增加,表明施用腐熟BOF 促進土壤中AM 菌根的生長。FAME 生物標記物可作為土壤健康和抑病性的指標,其中奇數(shù)脂肪酸組成比例能靈敏地反映新鮮和腐熟BOF 對土壤健康的調(diào)控效果。關(guān)鍵詞:番茄;生物有機肥;青枯病;土壤健康;FAMEEffect of FertiIization on the ControI of Tomato BacteriaI WiIt andSoiI HeaIth Restoration using FAME AnaIysisCAI Yan-fei ,LIAO Zong-wen(College Resource a

3、nd Environment ,South China Agricultural University ,Guangzhou 510642Abstract :The effect of applying biological organic fertilizer(BOF on soil microbial community and bacterial wilt of tomato was studied.The results showed that the occurrence of tomato wilt was 100%in control soil ,and reduced to 5

4、5%and 50%when applying uncomposted BOF and decomposed BOF respectively ,FAME analyses indicated that soil micro-bial community reflected sensitively after application of BOF.Soil FAME microbial biomass ,relative content of fungi ,ra-tio of fungi to bacteria were significantly increased under BOF tre

5、atment.The soil odd-number fatty acid proportion have changed application BOF ,and aC15:0,iC17:0decreased ,while cyC17:0increased in soil odd-number fatty acid pro-portion.Application BOF would strengthen soil health and disease suppression.The content of C16:111c in soil micro-bial community was ob

6、viously increased after application decomposed BOF.And it indicated that AM fungi improved un-der decomposed BOF application.FAME microbial biomarkers would be a useful indicator of soil health and disease sup-pression.Odd-number fatty acid proportion is a sensitive indicator of soil health regulati

7、ng effect following uncomposted and decomposed BOF applied ,respectively.Key words :Tomato ;Biological organic fertilizer ;Bacterial wilt ;Soil health ;FAME 收稿日期:2003-02-28基金項目:國家“863”計劃資助項目(2001AA246023和廣西壯族自治區(qū)青年基金資助項目(0007019作者簡介:蔡燕飛(1970-,女,湖南益陽人,助理研究員,博士,主要從事土壤微生物生態(tài)學(xué)研究。Tel :020-*;E-mail :yanfeic

8、ai 植物健康程度是土壤健康狀況的一個重要反映,植物病害發(fā)生(特別是土傳病害時被認為是生態(tài)系統(tǒng)處于不穩(wěn)定和不健康狀態(tài)1,2。長期以來用作物病情指數(shù)來估計土傳病害發(fā)生程度和土壤防病能力高低,而對土壤的內(nèi)在指標缺乏研究。實際上土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能變化的敏感響應(yīng)者。微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)與土傳病害和土壤健康狀況之間存在密切聯(lián)系。因此,土壤微生物群落中國農(nóng)業(yè)科學(xué)2003,36(8:922-927Scientia Agricultura Sinica和種類可用于估計土壤防病和健康程度3。但傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法僅分析了土壤微生物總數(shù)的0.1%至10%,也無法測定微生物群落結(jié)

9、構(gòu)和功能特征。近年來發(fā)展的脂肪酸分析(FAME和核酸分析法為土壤微生物研究提供了新的手段,與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)相比較,具有快速、直接、全面而準確等優(yōu)點4,5。FAME法能測定出土壤微生物群落脂肪酸指紋、微生物生物量和細菌、真菌生物量和功能微生物等,這些指標能估計土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康程度。由Ralstonia solanacearum引起的番茄青枯病是嚴重的土傳病害。青枯病發(fā)生與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系密切。Yoshitaka等6比較番茄青枯病抑病土和病土的微生物群落,發(fā)現(xiàn)青枯菌在微生物多樣性高的土壤中很難生存。作者用BIOLOG法分析表明,某些有機肥的施用能提高連作土壤中微生物群落的代謝能力和功能多樣性

10、,減少番茄青枯病7。這些研究表明,土壤微生物因子對番茄青枯病的發(fā)生有重要影響,很有必要進一步探討土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能微生物種類與番茄青枯病發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系。筆者在前期工作的基礎(chǔ)上,采用FAME法分析番茄連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征,并比較了施用新鮮和腐熟生物有機肥后連作地番茄青枯病的抑制效果和土壤生態(tài)系統(tǒng)健康的恢復(fù)水平。1材料與方法1.1試驗地點、材料及設(shè)計2O5 1.40%,K2O0.62%;腐熟BOF中含N3.53%,P2O5 1.92%,K2O1.59%。土壤中,翻耕、淋水潤濕土壤。其它田間管理措施一致。2氣流下?lián)]發(fā)掉溶劑。將提取的FAMEs溶解在0.5 ml1:1(v/v的正己烷:甲基

11、叔丁基醚(methyl-tert butyl ether中,作GC和GC-MS分析。番茄青枯病發(fā)病率采用直接計數(shù),即通過調(diào)查青枯病發(fā)病植株的數(shù)目與調(diào)查植株總數(shù)的比值,從而求得發(fā)病百分率,植株其它病害和生理死亡不計在內(nèi)。2結(jié)果與分析2.1不同處理對番茄青枯病發(fā)生率的影響連作地番茄青枯病發(fā)生嚴重。利用畜牧業(yè)廢棄物資源研制的生物有機肥對番茄青枯病有明顯的控制作用,在連作地對照土壤番茄青枯發(fā)生率100%3298期蔡燕飛等:FAME法分析施肥對番茄青枯病抑制和土壤健康恢復(fù)的效果的情況下,新鮮BOF 處理土壤番茄平均發(fā)病率50%,腐熟BOF 處理番茄平均發(fā)病率46%。方差分析表明,施生物有機肥顯著地降低了

12、番茄青枯發(fā)生率,腐熟BOF 處理比新鮮BOF 處理略好,但兩者之間無顯著差異。2.2各處理土壤微生物脂肪酸總量的比較本試驗結(jié)果表明,不同處理土壤微生物群落脂肪酸總量有明顯差異。腐熟BOF 處理、新鮮BOF 處理和對照的土壤微生物脂肪酸總量依次為63.753g g -1土、63.668g g -1土和37.930g g -1土,施肥處理土壤的脂肪酸總量顯著地高于對照土壤,但不同施肥處理土壤之間沒多大的差異。脂肪酸總量的差異可代表土壤微生物生物量的差異14,從而說明施用BOF 提高了土壤微生物生物量。2.3各處理土壤微生物主要奇數(shù)脂肪酸組成從圖1可知,施用BOF 使土壤微生物奇數(shù)脂肪酸組分中aC1

13、5:0和iC17:0的比例相對下降,而cyC17:0的相對比例顯著增加。但各處理土壤FAMEs /C16:0比值大于0.1的偶數(shù)脂肪酸的相對比例較恒定(圖2。aC15:0和iC17:0是土壤微生物革蘭氏陽性菌的特征標記物,cyC17:0是土壤微生物革蘭氏陰性菌的特征標記物9,由此說明施用BOF 明顯改變了土壤微生物群落中主要奇數(shù)脂肪酸組成比例。腐熟前后BOF 處理的土壤奇數(shù)脂肪酸組成差異較大,腐熟BOF 處理更有助于奇數(shù)脂肪酸中革蘭氏陰性菌比例增加和革蘭氏陽性菌比例下降。2.4各處理土壤真菌和細菌脂肪酸組成各處理土壤細菌、GN 細菌、GP 細菌和真菌脂肪酸含量與總脂肪酸量的百分比值, 以及真菌

14、脂肪酸 /卷表1各處理土壤微生物脂肪酸標記物的比較1Table1Comparison of FAME biomarkers in soil microbial community under different treatments處理Treatment細菌BacteriaGN細菌GN bacteriaGP細菌GP bacteria真菌Fungi真菌/細菌Fungi/bacteria1數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值標準誤,表中同列具有相同字母者,為經(jīng)DMRT法分析在0.05水平差異不顯著Each data is the average of3replicatesstandard error.DMRT

15、test,=0.05,n= 3圖3各處理土壤微生物FAMEs主成分圖dentified by PCA脂肪酸Fatty acid 第一主成分值PRIN1第二主成分值PRIN21選擇第一或第二主成分值0.1或0.1or-0.1is selected in table而C18:26是真菌的生物標記物。由此說明施用BOF處理的土壤真菌數(shù)量比對照土壤要高,而BOF 腐熟前后對土壤微生物群落中真菌的影響差異不大。C16:111c的第一主成分值為0.012、第二主成分值為0.151,C16:111c受第二主成分的影響比第一主成分要大得多,說明施用腐熟BOF有利于土壤微生物群落中C16:111c增加。C16:

16、111c是AM菌根的生物標記物,AM菌根具有促生防病和改良土壤的作用8。說明腐熟BOF處理后促進了土壤中AM菌根的生長,腐熟BOF比新鮮BOF更有利于土壤有益微生物的生長,從而有助于病原菌的抑制。也說明C16:111c可反映有機肥腐熟程度對土壤微生物群落的影響差異。cyC19:0的第二主成分值為0.548,說明施用腐熟的有機肥有利于土壤中GN細菌的生長,GN細菌比其它指標更能敏感地指示有機肥發(fā)酵程度對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響,這與前面的分析結(jié)果一致。3討論本研究結(jié)果表明FAME標記物與番茄青枯病發(fā)生存在密切聯(lián)系,施用BOF后土壤微生物群落中總FAME含量、真菌數(shù)量和真菌/細菌比值的增加與番茄青枯病發(fā)

17、生率的降低相一致。說明總FAME含量、真菌數(shù)量和真菌/細菌比值能估計BOF對連作土壤抑制病害能力增強的效果,這與現(xiàn)有文獻的報道是一致的。前人在分析免耕和傳統(tǒng)耕作、草原和農(nóng)業(yè)等土壤微生物群落中,發(fā)現(xiàn)土壤真菌數(shù)量和真菌/細菌比值提高與土壤健康程度增強有較好的一致性1113。另外土壤微生物總脂肪酸含量與微生物生物量顯著相關(guān)14,說明施肥提高了土壤微生物生物量。這些結(jié)果也表明總FAME含量、真菌數(shù)量和真菌/細菌比值能指示BOF對連作土壤健康恢復(fù)和番茄青枯病抑制的效果。結(jié)果表明,奇數(shù)脂肪酸組成比例可進一步用于估計土壤健康和防病能力的變化。各處理土壤微生物群落主要奇數(shù)脂肪酸組成比例存在明顯差異。aC15:

18、0、iC15:0的下降和cyC17:0的上升與土壤抑制青枯病的能力增加一致,這表明奇數(shù)脂肪酸組成5298期蔡燕飛等:FAME法分析施肥對番茄青枯病抑制和土壤健康恢復(fù)的效果比例可反映有機肥對土壤防病和健康的影響。此外,施用不同腐熟程度的BOF使土壤微生物奇數(shù)脂肪酸組成結(jié)構(gòu)變化明顯,這表明奇數(shù)脂肪酸組成還能反映不同發(fā)酵程度有機肥對土壤微生物群落的影響差異,從而更靈敏地反映土壤質(zhì)量變化。因此,奇數(shù)脂肪酸組成比例可作為土壤健康評價的指標。施用腐熟BOF后土壤細菌群落中GN細菌類群的比例明顯升高。這是由于土壤微生物通常處于貧營養(yǎng)狀態(tài),C底物是土壤微生物生長的主要限制因子。生物有機肥含有大量的可利用碳源,

19、施入土壤后,微生物可利用碳源相應(yīng)增加,GN細菌對土壤中碳源變化非常敏感,首先從中受益而數(shù)量增多。GN 細菌大多是快速生長類型,而快速生長型微生物對土壤養(yǎng)分水平的波動大多比其它類型的微生物敏感,還與土壤生態(tài)功能關(guān)系密切11,12。因此,施用腐熟有機肥比新鮮有機肥更有利于土壤生態(tài)系統(tǒng)功能增強。結(jié)果表明,FAME生物標記物能較好的估計施用有機肥后土壤生態(tài)系統(tǒng)防病力恢復(fù)程度。前人報道用FAME法研究表明微生物群落脂肪酸剖面和功能微生物脂肪酸組分(真菌、細菌、AM菌根、真菌/細菌比值等的相對變化與土壤健康波動呈較好的相關(guān)性,在重金屬、有機污染物、耕作制度、施肥、植被等對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響研究領(lǐng)域應(yīng)用較多

20、1113。筆者研究與前人的報道都顯示了FAME 法在土壤健康研究中的作用,也為進一步尋找土壤健康的定量指標和閾值提供了有效的方法,但前人尚無直接應(yīng)用于施肥對番茄青枯病調(diào)控效果的報道,本文是FAME法用于這領(lǐng)域的嘗試、結(jié)果顯示了土壤健康(防病力與施肥的聯(lián)系。FAME法在微生物群落分析和土壤質(zhì)量指標研究中具有重要意義,它能克服微生物培養(yǎng)的限制,能分析土壤可培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物信息,因而這一技術(shù)可全面地分析土壤微生物。但由于我們對土壤微生物群落的了解還很有限,FAME生物標記物分析還無法檢測到微生物種的水平。目前,土壤微生物脂肪酸分析主要有FAME法和PLFA(Phos-pholipid li

21、nked-FAME法10,FAME法不需要氯仿,樣品提取簡單、快速,能批量分析,對人體安全,不足之處是在提取土壤中脂肪酸時,沒有區(qū)分活的和死的微生物細胞。因此,在土壤微生物研究中,應(yīng)注意多種方法綜合運用,PLFA、FAME和BIOLOG法以及核酸分析相結(jié)合,相互印證以更準確地反映土壤微生物信息6,15。施用某些有機肥料能減輕作物病害的發(fā)生,長期以來人們持施肥改善作物的營養(yǎng)從而增強作物抗病力的觀點,對施肥后調(diào)控土壤微生物群落變化這一生態(tài)防病機制認識不足。筆者研究表明,施肥改善了土壤微生物群落結(jié)構(gòu),達到了控制病害和恢復(fù)土壤健康的效果。施入土壤中的有機肥可通過調(diào)整微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)而抑制和影響病原菌的生

22、長,從而降低土壤病原菌密度15。新鮮和腐熟有機肥的組成成分不同,提供給土壤微生物生長的營養(yǎng)基質(zhì)有差異,引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝活性的變化,進而影響土壤防病力和健康水平。FAME分析為施肥后土壤抗病力變化提供了土壤內(nèi)在的表征指標,這一指標與番茄青枯病病情指數(shù)有較好的一致性。因此FAME法在這一領(lǐng)域的應(yīng)用值得重視和深入研究。加強這一領(lǐng)域的研究對于土壤健康和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。References1Doran J W,Sarrantonio M,Liebig M A.Soil health and sustainabili-ty.Advance Agronomy,1996,56:2-54

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