白頭翁湯有效成分提取工藝的研究

1、白頭翁湯有效成分提取工藝的研究?60-中國(guó)民族民間醫(yī)藥Chinesejoumaofethnomedicineandethnopharmacy經(jīng)驗(yàn)交流Experiencecommunicate白頭翁湯有效成分提取工藝的研究劉文馮果劉夢(mèng)瑩林昶宋信莉貴陽中醫(yī)學(xué)院,貴州貴陽550001摘要:目的:優(yōu)選白頭翁湯有效成分提取的最佳提取方法和提取工藝.方法:以白頭翁湯中的有效成分白頭翁皂苷B和鹽酸小檗堿的含量為測(cè)評(píng)指標(biāo),采用單因素方差分析法與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選白頭翁湯有效成分的最佳提取方法和提取工藝.結(jié)果:最佳提取方法為滲漉法;最佳提取工藝條件為用80%的乙醇,以7ml/min/kg的流速,滲漉8倍量,回收

2、乙醇.結(jié)論:優(yōu)選后的提取工藝所獲得的白頭翁湯中的有效成分白頭翁皂苷B和鹽酸小檗堿的含量高,經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)表明該提取工藝穩(wěn)定,可行,能提高白頭翁湯的有效成分的含量.關(guān)鍵詞:白頭翁湯有效成分提取工藝白頭翁湯來源于傷寒論,是臨床常用的經(jīng)典方,由白頭翁,黃連,黃柏和秦皮4味藥組成,具有清熱解毒,涼血止痢之功效【l】.白頭翁湯藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是其湯劑中的化學(xué)有效成分,但由于該湯劑的化學(xué)有效成分用傳統(tǒng)的煎煮法提取時(shí),易受到溫度和提取溶劑,提取方法等方面的影響而不穩(wěn)定,方中有效成分生成大量的沉淀物質(zhì)【2】,降低了白頭翁湯的藥效作用.故本文以方中的有效成分為評(píng)價(jià)指標(biāo),運(yùn)用單因素方差分析與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法相結(jié)合來優(yōu)選提

3、取白頭翁湯有效化學(xué)成分的提取方法和提取工藝條件,為白頭翁湯的深入研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),也為湯劑復(fù)方化學(xué)成分的提取研究提供基本的研究方法.1儀器與材料Waters高效液相色譜儀(515HPLCPump,Waters2478Dualh紫外檢測(cè)器,威馬龍色譜數(shù)據(jù)工作站);KED型高速中藥粉碎機(jī);RE一52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;BT25S電子分析天平(德國(guó));實(shí)驗(yàn)用乙腈為色譜純,水為重蒸餾水;白頭翁皂苷B對(duì)照品購于長(zhǎng)沙拓康生物制品有限公司(HPLC歸一法測(cè)定純度大于98%),鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,數(shù)量(30mg/支),編號(hào):l10713;藥材均購于貴州同濟(jì)堂藥材公司,經(jīng)鑒定均為正品,質(zhì)量符

4、合2005版中華人民共和國(guó)藥典一部【3】的相關(guān)規(guī)定.2方法與結(jié)果2.1提取方法的建立根據(jù)白頭翁湯處方中藥材性質(zhì),以及相關(guān)的文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)不同的提取溶劑,單煎與合煎及溫度對(duì)白頭翁湯復(fù)方中的有效成分白頭翁皂苷,鹽酸小檗堿等有效成分有很大的影響,故建立以下提取方法進(jìn)行研究.A法:藥材單煎白頭翁藥材單煎取白頭翁藥材粗粉15g,加水煎煮三次,第一次加l0倍量水,煮沸l(wèi)h,過濾,藥渣再分別加6倍量水再提二次,每次30分鐘,過濾,合并濾液,濃縮,放冷,并定容至500ml,備用.黃連和黃柏藥材單煎取黃連和黃柏藥材粗粉分別6g,12g,加水煎煮三次,第一次加l0倍量水,煮沸l(wèi)h,過濾,藥渣再分別加6倍量水再提二次

5、,每次30分鐘,過濾,合并濾液,濃縮,放冷,并定容至500ml,備用.B法:水煎煮法(復(fù)方)稱取白頭翁湯處方量(白頭翁15g,黃柏12g,黃連6g秦皮12g)藥材粗粉,加水煎煮三次,第一次加10倍量水,煮沸1h,過濾,藥渣再分別加6倍量水再提二次,每次30分鐘,過濾,合并濾液,濃縮濾液,并定容至500ml,備用.C法:回流提取法(復(fù)方)稱取白頭翁湯處方量(白頭翁15g,黃柏12g,黃連6g,秦皮12g)藥材粗粉,加60%乙醇回流提取三次,第一次加8倍量60%乙醇,回流提取1h,過濾,藥渣再分別加6倍量60%乙醇再提二次,每次30分鐘,過濾,合并濾液,回收乙醇,濃縮,并定容至500ml,備用.D

6、法:滲漉法(復(fù)方)稱取白頭翁湯處方量(白頭翁15g,黃柏12g,黃連6g,秦皮12g)藥材粗粉,用60%的乙醇100ml拌勻,潤(rùn)濕后裝入滲漉筒內(nèi),再加60%的乙醇浸泡24h,用12倍量的60%的乙醇滲漉,控制流速在3ml/kg/min,低溫(60以下)回收乙醇并濃縮至適量,放冷,加水經(jīng)驗(yàn)交流Experiencecommunicate中國(guó)民族民間醫(yī)藥Chinesejournalofethnomedieineandethnopharmacy?61?定容至500ml,備用.2.2白頭翁皂苷B含量測(cè)定方法的建立2.2.1色譜條件色譜柱為InertsilODS一3C18(51.zm2504.6ram);

7、流動(dòng)相為乙腈一0.1%磷酸溶液(29:71);流速0.8ml?min;檢測(cè)波長(zhǎng)203nm;柱溫為常溫.2.2.2對(duì)照品溶液制備取白頭翁皂苷B4對(duì)照品加流動(dòng)相溶解成每lml含白頭翁皂苷B4對(duì)照品0.6mg的溶液,作為對(duì)照品溶液.2.2-3樣品溶液的制備分別精密吸取A,B,C,D法中樣品液各3ml,放置于10ml容量瓶中,加流動(dòng)相定容至刻度,搖勻,過0.451.zm濾膜,即得.2.2.4測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與樣品溶液各20l,注入液相色譜儀(對(duì)照品與樣品色譜圖分別見附圖1,圖2).圖1為測(cè)定白頭翁皂苷B對(duì)照品HPLC色譜圖圖2為測(cè)定白頭翁皂苷B供試品HPLC色譜圖2.2.5線性范圍考察精密

8、吸取白頭翁皂苷B對(duì)照品溶液1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0l注入液相色譜儀,測(cè)定峰面積,以白頭翁皂苷B進(jìn)樣量(g)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為Y=326273.1846X+7558.5482,r=0.9999.結(jié)果表明白頭翁皂苷B在0.607.2g與峰面積呈良好的線性關(guān)系.2.2.6精密度試驗(yàn)精密吸取白頭翁皂苷B對(duì)照品溶液l0,重復(fù)進(jìn)樣5次,記錄峰面積,結(jié)果精密度良好,RSD為0.80%.2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一樣品溶液,于0,1,2,4,6,8,12,24h分別進(jìn)樣20l測(cè)試,結(jié)果表明樣品液中的被測(cè)成分在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好.2.2

9、.8回收率試驗(yàn)精密稱取同一樣品6份,分別加入白頭翁皂苷B對(duì)照品5mg,制備樣品溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定.由測(cè)得量與加入量計(jì)算回收率,結(jié)果平均回收率為98.6%,RSD為0.55%,表明本方法回收率良好.2-3鹽酸小檗堿含量測(cè)定方法的建立2.3.1色譜條件色譜柱:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料(InertsilODS-351xm250x4.6ram);流動(dòng)相:乙腈一0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液(加磷酸調(diào)pH值至3.0)(30:70)檢測(cè)波長(zhǎng):346nm;流速:1.0ml/min;柱溫:30.2.3.2對(duì)照品溶液的制備:精密稱取在100C干燥5小時(shí)的鹽酸小檗堿對(duì)照品適量,加流動(dòng)相制成每lml含0.1m

10、g的溶液,即得.2-3.3樣品溶液的制備:分別精密吸取A,B,C,D法中樣品液各lml,放置于10ml容量瓶中,加流動(dòng)相定容至刻度,搖勻,過0.451.zm濾膜,即得.2.3.4測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與樣品溶液各10l,注入液相色譜儀(對(duì)照品與樣品色譜圖分別見附圖3,圖4).圖3為測(cè)定鹽酸小檗堿對(duì)照品HPLC色譜圖圖4為測(cè)定鹽酸小檗堿供試品HPLC色譜圖2.3.5線性范圍考察精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量,加流動(dòng)相制成每lml含0.1mg的溶液.再分別精密吸取上述溶液1,2,4,6l,8l,10,12l,按上述色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,以峰面積積分為縱坐標(biāo),以鹽酸小檗堿的進(jìn)樣量(g)為橫坐

11、標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程為Y=2934388.73l5x一127023.2266,r=0.9999,結(jié)果表明:鹽酸小檗堿在0.13501.6200ug進(jìn)樣范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.2.3.6精密度試驗(yàn)精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液10l,重復(fù)進(jìn)樣5次,記錄峰面積,結(jié)果精密度良好,RSD為0.16%.?62?中國(guó)民族民間醫(yī)藥Chinesejoumalofethnomedicineandethnopharmacy經(jīng)驗(yàn)交流Experiencecommunicate2.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液分別于0h,2h,4h,6h,8h,12h,24h,分另U進(jìn)樣101.d測(cè)試,結(jié)果表明樣品溶液在24小時(shí)

12、內(nèi)穩(wěn)定性良好.2.3.8回收率試驗(yàn)精密稱取同一樣品6份,分別加入鹽酸小檗堿對(duì)照品3mg,制備樣品溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定.由測(cè)得量與加入量計(jì)算回收率,結(jié)果平均回收率為99.1%,RSD為1.57%,表明本方法回收率良好.2.4提取方法的優(yōu)選按照上述含量測(cè)定方法,分別對(duì)A,B,C,D法樣品進(jìn)行含量測(cè)定,其白頭翁皂苷B和鹽酸小檗堿含量測(cè)定結(jié)果分別見表l,經(jīng)對(duì)其含量結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析(見表2),結(jié)果表明D>C>A>B,即D(滲漉)法優(yōu)于其它提取方法.2.5提取工藝條件的優(yōu)選從以上研究確定滲漉法為白頭翁湯有效成分的表1不同提取方法的含量測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)(.g/m1)最佳提取方法,運(yùn)用正

13、交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行滲漉提取工藝條件的優(yōu)選.2.5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在滲漉法中,乙醇濃度,乙醇用量,以及滲漉速度是影響處方中有效成分提取效果的主要因素,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法,每個(gè)因素3水平,按(3)正交表安排實(shí)驗(yàn).對(duì)滲漉提取條件進(jìn)行正交篩選,各因素水平見表3.2.5.2實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果分析表3因素水平表分別稱取白頭翁湯處方量的藥材粗粉,采用I_9(3)表安排實(shí)驗(yàn),分別進(jìn)行滲漉,低溫(60以下)回收乙醇并濃縮至適量,放冷,加水定容至500ml,并按2.2和2.3建立的含量測(cè)定方法分別對(duì)白頭翁皂苷B和鹽酸小檗堿進(jìn)行測(cè)定分析,結(jié)果見表4,表5及表6.從表4中直觀分析可見,各因素影響提取效率的順序以白頭翁皂苷B含量

14、考慮為A>C>B,以鹽酸小檗堿含量考慮,各因素影響提取效率的順序同樣為A>C>B,兩者結(jié)論一致.從表5,6方差分析結(jié)果表明,各因素對(duì)白頭翁皂苷B有影響,但無顯著影響,而A因素對(duì)鹽酸小檗堿的提取效率有極顯著影響,而B,C則無顯著影響,考慮到實(shí)際提取過程中的成本及提取效率因素,綜合選其最佳提取工藝條件為A.BlC.,即用80%的乙醇,以7ml/min/kg的流速,滲漉8倍量.2.5.3工藝驗(yàn)證取白頭翁,黃連,黃柏,秦皮藥材粗粉,按最佳工藝A,BlC.條件提取,測(cè)定白頭翁皂苷B和鹽酸小檗堿的含量以及總固體物,結(jié)果見表7.結(jié)果表明:白頭翁皂苷B4平均含量為2121.g/ml,R

15、SD為1.1l%,鹽酸小檗堿平均含量為98.941g/ml,RSD為0.8l%,總固體物平均收率為17.76%,RSD為0.59%說明工藝穩(wěn)定可行.3討論中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是復(fù)方中的化學(xué)有效成分,怎樣能充分地提取和利用中藥復(fù)方中的化學(xué)有效成分是中藥復(fù)方在臨床上藥效得以保證的關(guān)健.白頭翁湯是臨床上用于治療熱痢的經(jīng)典方,但是白頭翁湯用煎煮法獲得的湯劑,因受溫度,提取經(jīng)驗(yàn)交流Experiencecommunicate中國(guó)民族民間醫(yī)藥Chinesejoumal.fethnomedicineandethn.phamacy.63?表5白頭翁皂苷B含量方差分析表F0.05(2,2)=19.O0FO.O1(2,2)=99.O0表6鹽酸小檗堿方差分析表Fo(2,2)=19.O0Fo)1(2,2)=99.O0溶劑,提取方法等方面的影響,提取效果較差.在本實(shí)驗(yàn)中用傳統(tǒng)煎煮法提取的溶液中含白頭翁皂苷B4的平均含量為139.75501xg/ml,鹽酸小檗堿的平均含量為25.095Ixg/ml,不但有效成分不能充分地提取出來,甚至有效成分產(chǎn)生大量的沉淀21,這樣表7三批樣品工藝驗(yàn)證結(jié)果表方中的有效成分不能得到充分地利用,保證不了療效.而經(jīng)本研究采用單因素方差分析與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選法相結(jié)合優(yōu)選出的最佳提取方法和提取工藝所提取出的溶液中含白頭翁皂苷B4的平均含量為212.8