血紅素制備工藝研究進(jìn)展

1、血紅素制備工藝研究進(jìn)展瞿桂香1,2,3,黃耀江1,2,董明盛3(1 中央民族大學(xué),北京 100081;2 中國少數(shù)民族地區(qū)生態(tài)環(huán)境與資源保護(hù)研究所,北京 100081;3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇南京 210095摘 要: 本文詳細(xì)闡述了血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu),并從血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)出發(fā),說明從血液中提取血紅素的原理,即利用變性因素使血紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而變性,使血紅素上與珠蛋白結(jié)合的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂,從而使血紅蛋白中的血紅素與珠蛋白分離;或利用各種蛋白酶在其適當(dāng)pH 和溫度條件下將血紅蛋白上的珠蛋白水解,對(duì)酶解液的上清或沉淀進(jìn)行相關(guān)處理,獲得血紅素.本文還對(duì)血紅素提取的新老工藝以及改進(jìn)方法均作了較

2、為全面的闡述.關(guān)鍵詞: 血紅素;提取;工藝中圖分類號(hào):Q819 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1005 8036(200701 0019 04收稿日期:2006 08 21基金項(xiàng)目:北京市教委產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目和國家985支持項(xiàng)目作者簡介:瞿桂香(1978-,女(漢族,江蘇省南京市人,中央民族大學(xué)碩士研究生,主要研究方向?yàn)閯?dòng)物血液的蛋白質(zhì)工程. 血紅素(Heme是血紅蛋白、肌紅蛋白和紅細(xì)胞的輔基(活性部位,是一類重要的卟啉鐵化合物,廣泛存在于動(dòng)物的血液、肌肉和某些植物組織中.在血液中它存在于紅血球內(nèi)與其中構(gòu)成血紅蛋白的組分珠蛋白以非共價(jià)鍵形式相結(jié)合.血紅素鐵在腸腔內(nèi)可被腸黏膜細(xì)胞直接吸收,吸收率為25

3、%30%,且對(duì)腸道、胃壁不會(huì)造成損傷,并有較高的熱安全性,因此,它廣泛地應(yīng)用于藥品和保健食品,作為改善營養(yǎng)性貧血的主要原料.血紅素除了作為生物鐵治療營養(yǎng)性貧血外,還是治療惡性腫瘤的卟啉類藥物和治療急性、慢性遷延性、慢性活動(dòng)性肝炎的原卟啉二鈉鹽的前體1.我國于1998年正式批準(zhǔn)以血紅素為基本原料的血卟啉為抗腫瘤新藥.美國FDA 已于1983年7月正式批準(zhǔn)雅培公司的氯化血紅素作為藥品使用2.在肉制品工業(yè)中,血紅素也有廣闊的應(yīng)用前景,傳統(tǒng)的熏制熟肉制品加工工藝中,加入的發(fā)色劑亞硝酸鹽,有較大的致癌作用,血紅素作為發(fā)色劑及人工色素的替代品有很高的效果3.目前,有關(guān)血紅素的制備、應(yīng)用與檢測的報(bào)道很多,本

4、文將從血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)上對(duì)血紅素的提取和改進(jìn)方法加以綜述,并對(duì)目前報(bào)道較少的以酶解制備血紅素的方法進(jìn)行較詳細(xì)的敘述.1 血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)血紅蛋白是結(jié)合蛋白質(zhì),其蛋白質(zhì)部分稱為珠蛋白,屬組蛋白類,其輔基是血紅素,血紅素中所含的鐵為二價(jià).血紅蛋白及亞基的立體結(jié)構(gòu)如圖1、2所示4,血紅素結(jié)構(gòu)如圖35.血紅素與珠蛋白通過四鍵相結(jié)合,其中兩個(gè)鍵是血紅素上的兩個(gè)丙酸基與珠蛋白結(jié)合,另兩個(gè)是通過鐵與珠蛋白中組氨酸咪唑環(huán)的氮形成兩個(gè)配位鍵.此配位鍵中的一個(gè)當(dāng)血紅素與氧結(jié)合時(shí)被氧化取代.珠蛋白由四條肽鏈(兩條 鏈,兩條 鏈構(gòu)成, 鏈和 鏈氨基酸殘基順序不同,但兩者都相似, 鏈的空間結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白相似,盤繞成

5、8個(gè)螺旋節(jié)段(A 、B 、C 、D 、E 、F 、G 、H,而 鏈則盤繞成7個(gè)螺旋(A 、B 、C 、E 、F 、G 、H.這些螺旋節(jié)段之間由無規(guī)卷曲節(jié)段聯(lián)結(jié).無規(guī)卷曲分別用AB 、BC 、CD 、EF 、FG 、GH 、HC 等表示.這些節(jié)段按一定空間方位折迭就形成三級(jí)結(jié)構(gòu),其亞基再依靠次級(jí)鍵形成四級(jí)結(jié)構(gòu).珠蛋白含2007年2月第16卷 第1期中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版Journal of the CUN(Natural Sciences EditionFeb.2007Vol.16 No.1有較多的組氨酸和賴氨酸 .圖1 血紅蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fi g.1 The structure of h

6、emogl obi n珠蛋白的每個(gè)亞基都與一個(gè)亞鐵血紅素相連.亞鐵血紅素位于E 、F 兩個(gè)螺旋節(jié)段之間.此處有一個(gè)由疏水氨基酸殘基構(gòu)成的空間稱為疏水口袋(Hydrophobic bag,亦稱血紅素口袋(He me bag.血紅素分子中的Fe 2+在血紅素平面的一側(cè)與肽鏈中的一個(gè)組氨酸殘基以配位鍵相連.Fe 2+和O 2相連在平面的另一側(cè),其鄰近處有另一個(gè)組氨酸殘基( 58或 63稱為遠(yuǎn)心組氨酸6.亞鐵血紅素分子除亞鐵離子以外,另一部分為原卟啉(Protoporphyrin ,它是一種重要的卟啉衍生物,在亞鐵血紅素中存在的是原卟啉.原卟啉上的兩個(gè)N 原子與鐵以共價(jià)鍵相結(jié)合;另外兩個(gè)N 原子則以配

7、位共價(jià)鍵與Fe 2+相結(jié)合,整個(gè)分子處于共振狀態(tài).2 血紅素提取機(jī)理從血紅蛋白的結(jié)構(gòu)看,在正常條件下, 亞鐵血紅素圖2 血紅蛋白 亞基的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 The thi rd structure of the chain of hemoglobin 與蛋白緊緊結(jié)合在一起,很難把它們拆分開來,但是由于變性因素(如加熱,pH 變化,脲、胍等變性劑的存在,導(dǎo)致血紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而變性,使血紅素上的丙酸基與珠蛋白結(jié)合的兩個(gè)化學(xué)鍵及血紅素中的鐵與珠蛋白組氨酸咪唑環(huán)的氮形成的兩個(gè)配位鍵斷裂,從而使血紅蛋白中的血紅素與珠蛋白分離.利用各種蛋白酶在其適當(dāng)pH 和溫度條件下將血紅蛋白上的珠蛋白水解,對(duì)

8、酶解液的上清或沉淀進(jìn)行相關(guān)處理,獲得血紅素.3 血紅素提取方法血紅素提取方法主要有有機(jī)溶劑法、酶水 解法、圖3 血紅素的結(jié)構(gòu)Fi g.3 The s tructure of he meCMC 法、表面活性劑法.3 1 有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法主要包括冰醋酸法、丙酮法.1885年俄國學(xué)者最早在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用冰醋酸,氯化鈉和血共熱得到血紅素結(jié)晶,此后Nippe 氏在原有反應(yīng)的基礎(chǔ)上,在冰醋酸中加入少量NaCl,KCl,KBr,KI 和血共熱得到血紅素結(jié)晶,用此法制備少量血紅素結(jié)晶速度更快,該法目前在工業(yè)上和實(shí)驗(yàn)室大量制備血紅素的情況下仍被使用.冰醋酸法雖具有簡單易行的特點(diǎn),但收率低,提取溫度高(10010

9、5 .血蛋白和溶20中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版第16卷劑回收難,增加了生產(chǎn)成本,廢液處理不當(dāng)還會(huì)造成污染7.1975年Lindroos 等人提出了使用酸性丙酮分離提取血紅素的方法,也是目前使用最多的方法.在pH 3的鹽酸丙酮溶液中、亞鐵血紅素與珠蛋白脫離,亞鐵血紅素變成氯化血紅素并溶于酸性丙酮溶液中,而珠蛋白則變性沉淀.具體的工藝:紅細(xì)胞加適量水,進(jìn)行機(jī)械攪拌細(xì)胞破碎30min 后,加入紅細(xì)胞5倍體積的3%的酸性丙酮溶液,用1mol L 的鹽酸調(diào)溶液的pH 值至23,抽提10min 后,離心收集上層溶液.上層溶液中加入1mol/L 的氧氧化鈉(調(diào)溶液的pH 值為46、醋酸鈉可得到氯化血紅素結(jié)

10、晶,這種方法稱為醋酸鈉法;上層溶液加入5%的鞣酸也可以得到氯化血紅素結(jié)晶,這種方法稱為鞣酸法;或直接將上層溶液蒸餾,一方面可以得到氯化血紅素,一方面也可以回收丙酮,這種方法稱為蒸餾法8.目前,對(duì)提取血紅素的方法進(jìn)行改進(jìn)的報(bào)道很多.李秀玲等9利用蛋白沉淀劑沉淀血紅蛋白,可使丙酮溶劑的用量降至老工藝的一半,產(chǎn)品純度可提高到99%,并且每升紅細(xì)胞能得到血紅素56g.宋照軍等10人在溶血中加入0 15倍氯仿,可使細(xì)胞膜破裂和溶解同時(shí)進(jìn)行,血紅蛋白從血細(xì)胞中較完全分離出來,提高血紅素的得率.王君等用超聲波細(xì)胞破碎法代替機(jī)械攪拌細(xì)胞破碎法,用蒸餾法提取氯化血紅素所得產(chǎn)品的純度達(dá)到了96%,收率達(dá)到了90%

11、11.3 2 酶水解法這種方法沒有用到有機(jī)溶劑,被認(rèn)為是最環(huán)保的一種提取血紅素的方法,但目前關(guān)于酶法制備血紅素的報(bào)道較少.湯鳳霞等人12用胰酶水解血紅蛋白制備水解蛋白液,其過程是酶解液經(jīng)調(diào)pH 值為4 5,然后離心分離,讓血紅素沉淀下來,上清液中含有的少量有色成分用活性炭吸附去除,從而獲得所需的水解蛋白,但他們沒有對(duì)沉淀作進(jìn)一步的處理;史九根等13人比較了胰酶和細(xì)菌蛋白酶對(duì)豬血的酶解效果,通過正交實(shí)驗(yàn)選出最佳工藝條件,以水解度為指標(biāo),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胰酶和蛋白酶的酶解效果都較好,并且用蛋白混合酶比單一酶效果更佳,但對(duì)酶解液中血紅素的提取亦沒有進(jìn)一步報(bào)道.最新的報(bào)道以酶法水解血紅蛋白制備血紅素14,

12、具體方法是,在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H 條件下,先后用中性蛋白酶和風(fēng)味酶進(jìn)行水解,水解過程加入抗氧化劑以防止亞鐵氧化成三價(jià)鐵,水解程度以水解度作為指標(biāo),即氨基氮與總氮的比值百分比.然后對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行超濾,并且測定濾過液和滯留液中亞鐵血紅素和肽的含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酶解液經(jīng)10kD 濾膜超濾后再經(jīng)3kD 濾膜超濾,超濾的滯留液中亞鐵血紅素與肽的比值達(dá)到9 92%,即制備出富亞鐵血紅素肽溶液,這是目前少數(shù)關(guān)于酶解制備血紅素較完整的報(bào)道之一.國內(nèi)也有以胃蛋白酶或動(dòng)物胃粘膜制備食用血紅素的專利,具體是以胃蛋白酶或動(dòng)物胃粘膜將動(dòng)物血的蛋白質(zhì)水解,使血紅蛋白所含的血紅素形成不溶性膠狀沉淀,通過煮沸,中和及過濾或離心

13、將血紅素與蛋白水解物分離.3 3 CMC 法印韻芝等將新鮮血液離心分離出的紅細(xì)胞加水溶血后再加酸(可用硫酸,調(diào)溶液pH 值為3 0,然后在酸性溶液中加入羧甲基纖維素,靜置一段時(shí)間,離心分離即得到深褐色的血紅素鐵.得到的產(chǎn)品不需洗脫,將血紅素和羧甲基纖維素直接作原料藥壓片用作抗貧血藥.同時(shí),Auto 15使用可溶性C MC 來拆分牛血紅蛋白,利用C MC 稀釋液加入溶血的紅細(xì)胞中,結(jié)合生成C MC 血紅素復(fù)合物,經(jīng)離心沉淀分離.3 4 表面活性劑法該法的發(fā)明者發(fā)現(xiàn),在鹽酸酸化的血紅蛋白溶液中加入適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣?然后以適當(dāng)?shù)姆椒訜?這時(shí)血紅蛋白不會(huì)沉淀,而氯化血紅素則可以從溶液中沉淀出來.如果

14、加入氯化血紅素的晶種,則結(jié)晶更順利.表面活性劑的種類可以是非離子、陽離子、兩性表面活性劑或它們的混合物.除了以上方法,還有一種是堿基物 有機(jī)溶劑法16.該法為日本佐藤治男發(fā)明.用含有堿基物質(zhì)的有機(jī)溶劑,使血紅蛋白中的血紅素與珠蛋白分解,血紅素呈溶解狀態(tài),而珠蛋白則以固形物沉淀.這種方法適用于脊椎動(dòng)物的血液,除了用新鮮血液外,還可以用噴霧干燥的血粉.目前,對(duì)此法報(bào)道的文獻(xiàn)較少.此外,張煒煜等采用氯仿為溶劑,豬血粉與乙醇進(jìn)行酯化反應(yīng),得血紅素二乙酯,然后用氫氧化鈉溶液進(jìn)行水解,再用鹽酸溶液酸化,將析出的晶體用水洗至中性.用此法生產(chǎn)的血紅素其純度可達(dá)80%以上.21 第1期瞿桂香等:血紅素制備工藝研

15、究進(jìn)展22中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版第16卷 這是國內(nèi)關(guān)于血紅素提取方法的最新報(bào)道.4 問題和展望盡管血紅素提取的方法有所改進(jìn),但要真正應(yīng)用于生產(chǎn)需要考慮以下幾個(gè)問題:一、降低成本;二、提取的過程中盡量避免使用毒性較大、難以回收的有機(jī)溶劑,做到環(huán)保生產(chǎn).而用于食品或作為鐵強(qiáng)化劑更重要的是考慮其安全性,有機(jī)溶劑殘留給健康造成隱患,因此不使用有機(jī)溶劑的酶解制備血紅素的方法將是發(fā)展的方向,但是此方法還不成熟,尤其是血紅素的氧化以及溶解性問題,尋找合適的抗氧化劑或還原劑以及考慮微囊化改善溶解性等還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究.參考文獻(xiàn):1 周淡宜,徐水祥,等.血紅素純化技術(shù)研究J.藥物生物技術(shù),2004,11

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