褚泰偉應(yīng)用化學(xué)基礎(chǔ)-第九章 放射性在化學(xué)中的應(yīng)用ppt課件

1、1第九章 放射性示蹤技術(shù)在化學(xué)、生物研究中的應(yīng)用2證明DNA是遺傳物質(zhì) 歷史上，生物學(xué)家在細(xì)胞中總是沒(méi)有辦法找到承擔(dān)遺傳功能的物質(zhì)，曾經(jīng)一度認(rèn)為蛋白質(zhì)是遺傳物質(zhì)，因?yàn)樗袚?dān)了生命活動(dòng)的絕大部分功能。 1952年赫爾希(Hershey)和沙斯(Chase)兩人利用噬菌體證明了DNA的遺傳功能，為最終確立DNA是主要的遺傳物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。 他們把宿主細(xì)菌分別培養(yǎng)在含有35S和32P的培養(yǎng)基中,宿主細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，就分別被35S和32P所標(biāo)記。 然后，赫爾希等人用T2噬菌體分別去侵染被35S和32P標(biāo)記的細(xì)菌。噬菌體在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)增殖，裂解后釋放出很多子代噬菌體，在這些子代噬菌體中，前者被35S所標(biāo)

2、記，后者被32P所標(biāo)記。3 接著，他們用被35S和32P標(biāo)記的噬菌體分別去侵染未標(biāo)記的細(xì)菌，然后測(cè)定宿主細(xì)胞的同位素標(biāo)記。當(dāng)用35S標(biāo)記的噬菌體侵染細(xì)菌時(shí)，測(cè)定結(jié)果顯示，宿主細(xì)胞內(nèi)很少有同位素標(biāo)記，而大多數(shù)35S標(biāo)記的噬菌體蛋白質(zhì)附著在宿主細(xì)胞的外面；當(dāng)用32P標(biāo)記的噬菌體感染細(xì)菌時(shí)，測(cè)定結(jié)果顯示宿主細(xì)胞的外面的噬菌體外殼中很少有放射性同位素32P，而大多數(shù)放射性同位素32P在宿主細(xì)胞內(nèi)。 以上實(shí)驗(yàn)表明，噬菌體在侵染細(xì)菌時(shí)，進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)的主要是DNA，而大多數(shù)蛋白質(zhì)在細(xì)菌的外面。可見(jiàn)，在噬菌體的生活史中，只有DNA是在親代和子代之間具有連續(xù)性的物質(zhì)。因此，DNA是遺傳物質(zhì)。由此，Herhey于是

3、1962年獲諾貝爾獎(jiǎng)。4放射性分子檢測(cè)技術(shù)概述：放射性分子檢測(cè)技術(shù)概述： 1、1952年，年，Hershey和和Chase以以32P和和35S分別標(biāo)記分別標(biāo)記T2噬菌體的噬菌體的DNA與蛋白與蛋白質(zhì)、標(biāo)記質(zhì)、標(biāo)記T2噬菌體大腸桿菌，直接證明噬菌體大腸桿菌，直接證明了了DNA是遺傳物質(zhì)。由此，是遺傳物質(zhì)。由此，Herhey于是于是1962年獲諾貝爾獎(jiǎng)。年獲諾貝爾獎(jiǎng)。 2、1958年，年，Meselson和和Stahl使用使用15N15NH4Cl示蹤技術(shù)，確證了示蹤技術(shù)，確證了DNA的半保留復(fù)制模型，闡明了的半保留復(fù)制模型，闡明了DNA自自身復(fù)制的機(jī)制。身復(fù)制的機(jī)制。5 3、1956年，Kornb

4、erg等用32P標(biāo)記DNA的前身物脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸等的第一個(gè)磷酸，證明大腸桿菌抽出液中存在DNA聚合酶經(jīng)后人證明這種酶是DNA損傷時(shí)一種修復(fù)酶。A、Kornberg于1959年獲諾貝爾獎(jiǎng)。） 4、1963年、Bermardhall等用3H標(biāo)記DNA，32P標(biāo)記RNA，證明了DNA在RNA合成過(guò)程中起模板作用。 5、1968年，Nirenberg(1961)，由于其14C一苯丙氨酸的多肽化被確證證明遺傳信息是從DNA通過(guò)mRNA傳遞到蛋白質(zhì)即“中心法則”，又稱遺傳密碼的翻譯一的直接實(shí)驗(yàn)而獲諾貝爾獎(jiǎng)。還有DNA的重組32P、3H），近20年的分子生物成就。679.1. 放射性核素示蹤法 示蹤劑是一種

5、帶有特殊標(biāo)記的物質(zhì)，當(dāng)它加入到被研究的對(duì)象中后，人們可以根據(jù)示蹤劑的運(yùn)動(dòng)和變化，來(lái)洞悉原來(lái)不易或者不能辨認(rèn)的被研究對(duì)象的運(yùn)動(dòng)和變化規(guī)律。 將已知總放射性的示蹤劑Cr-51-紅細(xì)胞注入血液循環(huán)。待混合稀釋后一般在注射后10-15min抽取一個(gè)血液樣品，測(cè)定每毫升的放射性，就能算出待測(cè)的人體血容量。此法不需要處理樣品，快速而準(zhǔn)確。8 靈敏：可示蹤微量物質(zhì)的性質(zhì)和行為 1Ci的32P相當(dāng)于61010個(gè)32P原子，質(zhì)量?jī)H為10-12g。 一般的放射性探測(cè)器可定量測(cè)定1nCi的放射性，因此可檢測(cè)的放射性核素的量為 10-13 10-19g。9.1.1 放射性核素示蹤法的特點(diǎn)靈敏度高靈敏度高 化學(xué)分析法：

6、一般化學(xué)分析法：一般10-6g 光譜法：光譜法：10-1010-12g 示蹤法：示蹤法：10-1410-18g 例例 32P： A(Bq) 3.7 104 質(zhì)量質(zhì)量g） 3.510-12 很容易測(cè)量很容易測(cè)量3.7Bq910 簡(jiǎn)單，易分辨： 通過(guò)各種射線探測(cè)儀測(cè)量放射性來(lái)定量或定性，不受非放射性物質(zhì)的干擾； 勿需分離提純； 在生物、醫(yī)學(xué)研究中可從體外測(cè)量，不影響正常生物活動(dòng)。9.1.1 放射性核素示蹤法的特點(diǎn)11 提供原子、分子水平的研究手段： 化學(xué)平衡時(shí)的反應(yīng)速率，有機(jī)化合物的分子重排，異構(gòu)化、反應(yīng)機(jī)理； 模擬水平高： 模擬真實(shí)的環(huán)境條件。由于用量少，不影響生物體的正常生理過(guò)程，不影響環(huán)境過(guò)

7、程的正常變化?？捎糜谘芯克幬锏亩纠怼h(huán)境的變化。9.1.1 放射性核素示蹤法的特點(diǎn)12 定位可靠：在生物和環(huán)境研究中，不僅能準(zhǔn)確定量測(cè)量，而且可以用放射性自顯影技術(shù)確定其在組織器官中的分布情況，與病理組織的切片技術(shù)結(jié)合，可進(jìn)行細(xì)胞水平的定位；與電子顯微鏡技術(shù)結(jié)合，可進(jìn)行亞細(xì)胞水平的定位觀察。9.1.1 放射性核素示蹤法的特點(diǎn)139.1.2 放射性示蹤法的分類 簡(jiǎn)單示蹤法： 在所研究的物質(zhì)中加入放射性物質(zhì)，二者簡(jiǎn)單地混合，根據(jù)放射性物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)情況，考察研究對(duì)象的運(yùn)動(dòng)規(guī)律。 放射性浮標(biāo)測(cè)密封容器中的液面高度；46Sc加到流沙中，研究流沙的運(yùn)動(dòng)和沉降規(guī)律；131I跟蹤白蟻的活動(dòng)規(guī)律。149.1.2

8、放射性示蹤法的分類 物理混合法： 示蹤劑與研究對(duì)象均勻混合，使其比例保持不變，通過(guò)對(duì)示蹤劑的測(cè)量，可定量地研究研究對(duì)象的性質(zhì)和行為。 32P標(biāo)記測(cè)量人體的血液總體積將一定量的32P注入人體，混合一定時(shí)間后，抽取一定量的血液） V=V0(s0/s+1)159.1.2 放射性示蹤法的分類 同位素示蹤法： 根據(jù)同位素具有相同化學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)，用放射性同位素或其標(biāo)記化合物作為被研究元素或化合物的示蹤劑； 示蹤劑能正確地反映研究對(duì)象在物理、化學(xué)和生物過(guò)程中的性質(zhì)和行為。169.1.3 放射性示蹤劑的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵筮M(jìn)行選擇：半衰期：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)周期，選擇半衰期適當(dāng)?shù)姆派湫院怂?；?500多種放

9、射性核素中，t1/21h的約占50%， 1h24h的約占20%，1d的約占30%。179.1.3 放射性示蹤劑的選擇 目前常用的有200多種放射性核素； 半衰期太短要求操作簡(jiǎn)便省時(shí)，測(cè)量快速； 半衰期太長(zhǎng)測(cè)量困難，難獲得高比活度樣品； 一般選擇 數(shù)小時(shí)t1/2 數(shù)百天 體內(nèi)使用的放射性核素，在能滿足示蹤要求的前提下，盡量選擇短半衰期的核素。189.1.3 放射性示蹤劑的選擇 輻射類型和能量： 既要考慮便于測(cè)量，也要考慮輻射效應(yīng)； 一般不用放射性核素治療用），常用和核素； 射線核素探測(cè)效率高，易于防護(hù) ( 32P, Emax=1.709MeV; 3H, Emax=0.00186MeV) ;199

10、.1.3 放射性示蹤劑的選擇 射線核素穿透性好，一般選用能量在100600keV的射線；在該能量范圍內(nèi)，既可穿透機(jī)體，被掃描儀或照相機(jī)的探頭所記錄，又不至于穿透掃描儀或照相機(jī)的準(zhǔn)直器而影響空間分辨率； 用于臟器掃描的射線核素最好不發(fā)射射線、內(nèi)轉(zhuǎn)換電子和Auger電子，這些射線只增加病人的吸收劑量，而不能提供有用信息。209.1.3 放射性示蹤劑的選擇 放射性活度： 使用過(guò)程中往往被稀釋，要求原始比活度高；但由于安全因素，比活度不宜過(guò)高； 一般根據(jù)稀釋倍數(shù)、最后測(cè)量的量和測(cè)量效率來(lái)確定適當(dāng)?shù)谋然疃?219.1.3 放射性示蹤劑的選擇 放射性核素的純度： 生產(chǎn)中，由于副反應(yīng)、靶物中存在雜質(zhì)，使放射

11、性不純，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，放射性雜質(zhì)會(huì)增加病人的吸收劑量，影響診斷和病人健康； 使用之前，要進(jìn)行純度檢驗(yàn)。229.1.3 放射性示蹤劑的選擇 放射性核素的毒性： 盡量使用低毒性核素。若有毒，要盡量控制用量。 生物半衰期： 選用生物半衰期短的核素。23同位素效應(yīng)：對(duì)于較輕的元素，由于原子量的倍數(shù)差異較大，使他們的化學(xué)性質(zhì)顯著不同，必須考慮。同位素效應(yīng)隨著原子序數(shù)的增大而減小。核衰變及輻射自分解：衰變生成子體以及自身電離輻射作用下產(chǎn)生自分解，使純度受到影響，引起實(shí)驗(yàn)誤差。降低放射性比活度或?qū)?biāo)記分子稀釋分散，可使輻射自分解顯著減小。9.1.4 放射性示蹤法中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題249.2 放

12、射性核素在化學(xué)中的應(yīng)用9.2.1 在化學(xué)反應(yīng)機(jī)理研究中的應(yīng)用鑒別化學(xué)反應(yīng)中有關(guān)的化合物鑒別化學(xué)反應(yīng)的中間產(chǎn)物研究反應(yīng)中各中間產(chǎn)物的前后次序確定化學(xué)鍵斷裂的位置研究大分子的形成過(guò)程25一、鑒別化學(xué)反應(yīng)中有關(guān)的反應(yīng)物 在14CO2參加植物的光合作用中，在見(jiàn)光短時(shí)間內(nèi)，可以從植物中分離得到三十多種含有14C的化合物。可以得知，這些化合物都是由CO2開(kāi)始的光合作用生成的。 最終產(chǎn)物的前身是什么？用13C標(biāo)記有可能是尿酸前身的各種化合物喂給鴿子，然后分析排泄物中的尿酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，碳酸鹽、甲酸鹽、醋酸鹽等都參加了尿酸的合成反應(yīng)。假如反應(yīng)經(jīng)過(guò)A B C，從A到C是否經(jīng)過(guò)了中間產(chǎn)物B?？刹扇∫韵虏襟E：26二、

13、鑒別化學(xué)反應(yīng)的中間產(chǎn)物 在體系中加入A*，檢查B中是否有A*出現(xiàn)。 在體系中加入B*，檢查C中是否有B*出現(xiàn)。 在體系中加入大量非放射性的B，檢查C中的B*是否減少。 如果答案是肯定的，說(shuō)明有中間過(guò)程應(yīng)排除同位素交換）；如果答案是否定的，則無(wú)中間過(guò)程。例如：從鉻酸鹽溶液電解制金屬鉻，是否有Cr(III)中間產(chǎn)物。將51Cr標(biāo)記在鉻酸鹽(A)上，沉積物(C)有放射性，但將51Cr標(biāo)記在Cr(III)上(B)，沉積物中沒(méi)有放射性，已經(jīng)證明Cr(III)與鉻酸鹽的同位素交換非常慢，因此可以證明Cr(III)不是中間產(chǎn)物。27三、研究反應(yīng)中各中間產(chǎn)物的前后次序三、研究反應(yīng)中各中間產(chǎn)物的前后次序例：已知

14、碘化物進(jìn)入人體后，可生成一碘酪氨酸、二碘酪氨酸和甲狀腺素，為了研究這一過(guò)程，可將用I-131標(biāo)記的碘化物注入動(dòng)物體內(nèi)，在不同時(shí)間測(cè)出動(dòng)物體內(nèi)上述三種有機(jī)物的比放射性活度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在開(kāi)始的短時(shí)間內(nèi)10分鐘），一碘酪氨酸的放射性最強(qiáng)，幾小時(shí)后，一碘酪氨酸與二碘酪氨酸的比放射性幾乎相同，但比甲狀腺素強(qiáng)，直到2-3天后，最終產(chǎn)物的放射性比活度與前兩個(gè)產(chǎn)物相等，因而可得中間產(chǎn)物順序?yàn)椋?碘化物- 一碘酪氨酸- 二碘酪氨酸- 甲狀腺素28四、確定化學(xué)鍵斷裂的位置在研究化合物降解時(shí)，常常需要知道化學(xué)鍵斷裂的位置。例如：丙酸氧化時(shí)，產(chǎn)物為CH3COOH和CO2，到底斷開(kāi)的是哪一個(gè)C-C鍵，可以用示蹤方法確定

15、。又如分子重排反應(yīng)機(jī)理，也常用示蹤原子方法。2930 克萊森重排：苯丙烯醚重排成為鄰丙烯基苯酚 O-CH2-CH=CH22000COHCH2-CH=CH2 表面上看，似乎是O-CH2鍵斷裂 31 確定示蹤劑的位置為：O-CH2-CH=14CH22000COH14CH2-CH=CH2 說(shuō)明克萊森重排是分子內(nèi)重排五、研究大分子的形成過(guò)程示蹤原子方法在研究大分子在生物體中形成過(guò)程中有很重要的意義。例如：研究動(dòng)物脂肪酸的形成過(guò)程，將CH3*COOH注射到山羊體內(nèi)，分析羊乳脂肪樣品，發(fā)現(xiàn)脂肪酸中的丁酸在羧基和碳原子上有*C，分子式為：CH3*CH3CH2*COOH ，這表明丁酸是由兩個(gè)醋酸分子縮合而成的

16、。還發(fā)現(xiàn)己酸中的*C是間隔出現(xiàn)在碳鏈上，且-*COOH上特別強(qiáng)。這表明，己酸是分步合成的。即：先生成有*C的丁酸，隨后被非放射性的丁酸所稀釋，最后與第三個(gè)醋酸分子縮合。 32339.2.2 在化學(xué)中的其他應(yīng)用 分配比和分離因數(shù)的測(cè)定 配合物穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定 溶液中自擴(kuò)散系數(shù)的測(cè)定 擴(kuò)散物質(zhì)在球形固體中的自擴(kuò)散系數(shù)的測(cè)定 金屬自擴(kuò)散系數(shù)的測(cè)定 晶體比表面的測(cè)定 溶解度的測(cè)定一、分配比和分離因數(shù)的確定 分配比(distribution ratio)：兩相中各種形式總濃度之比。 Di=i/Ci i- mmol/g 分配系數(shù)(distribution coefficient)：兩相中平衡濃度之比。 i=

17、Mi/Ci Mi-mmol/ml 分配比和分配系數(shù)都是用來(lái)表示交換反應(yīng)中某一離子在平衡分配時(shí)的參數(shù)，其區(qū)別在于固相濃度的表示方式不同，因而其應(yīng)用場(chǎng)合不同。34 選擇系數(shù)(selectivity coefficient)：表示兩種離子對(duì)樹(shù)脂親和力的差別。例如：對(duì)反應(yīng) a A + b B a A + b B KAB= Aa Bb/Aa Bb 選擇系數(shù)的數(shù)值因采用的濃度單位不同而異。選擇系數(shù)越大，表示A、B兩種離子對(duì)樹(shù)脂的親和力差別越大。35 分離因數(shù)(separation factor)： 分離因數(shù)表示兩種離子在達(dá)成離子交換平衡后所取得的富集效果。 AB = (A/B)/(A/B) = DA/DB

18、 分離因數(shù)從數(shù)值上等于平衡分配時(shí)A和B組分在樹(shù)脂相的濃度比對(duì)溶液相的濃度比的商值。 分離因數(shù)和選擇系數(shù)的差別在于它與參加交換的離子價(jià)數(shù)無(wú)關(guān)。36用放射性示蹤原子的辦法，可以很容易測(cè)得上述各種參數(shù)。方法是：將放射性標(biāo)記的待測(cè)核素配成溶液，然后加入一定量的樹(shù)脂，分別測(cè)量原始溶液和平衡時(shí)溶液的放射性活度，即可計(jì)算出平衡時(shí)固液兩相的放射性活度，以此可以可以計(jì)算出分配比等參數(shù)。37二、配合物穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定一、測(cè)定原理關(guān)鍵是引入配合度和函數(shù)。然后逐級(jí)外推，即可求得1、2n。二、實(shí)驗(yàn)方法：通常是先用實(shí)驗(yàn)求得無(wú)配體時(shí)的分配比D和有配體時(shí)的分配比D，以log(D/D-1)對(duì)logL作圖，從直線截距可求得logn

19、，由斜率求得配位數(shù)n。由于示蹤原子方法靈敏度高，可以在中心離子濃度非常低時(shí)進(jìn)行。38三、溶液中自擴(kuò)散系數(shù)的測(cè)定 在濃度不均勻的體系中，發(fā)生物質(zhì)的均勻擴(kuò)散(濃差擴(kuò)散)，可用Fick第一定律來(lái)描述 J=-D(c/x) J是擴(kuò)散物質(zhì)的流量，c為擴(kuò)散物質(zhì)的濃度，x為擴(kuò)散方向上的坐標(biāo)(間隔)，D為擴(kuò)散系數(shù)。負(fù)號(hào)表示擴(kuò)散是沿著濃度減小(c/xWx：Wx=WOSm/So4849 顯然，在上述方法中必須從體系分出一部分待測(cè)物，并測(cè)定其放射性比活度，這就需要用重量法或其它的物理化學(xué)方法來(lái)分析測(cè)定所分出的那一部分純物質(zhì)的準(zhǔn)確含量?？梢?jiàn)，經(jīng)典的直接同位素稀釋法靈敏度實(shí)際上取決于其它分析方法，分析的靈敏度受到限制。5

20、0)1(00XXAAWWAAWWXX00（三）（三） 亞化學(xué)計(jì)量稀釋法：亞化學(xué)計(jì)量稀釋法： 亞化學(xué)計(jì)量同位素稀釋法亞化學(xué)計(jì)量同位素稀釋法(Substoichiometric IDA)是是要在分析操作中創(chuàng)造一個(gè)分離條件，使得從標(biāo)準(zhǔn)溶液和經(jīng)要在分析操作中創(chuàng)造一個(gè)分離條件，使得從標(biāo)準(zhǔn)溶液和經(jīng)過(guò)稀釋的樣品溶液中分離出來(lái)的待測(cè)物的重量相等，那么過(guò)稀釋的樣品溶液中分離出來(lái)的待測(cè)物的重量相等，那么它的放射性比活度之比就等于放射性強(qiáng)度之比，此時(shí)上式它的放射性比活度之比就等于放射性強(qiáng)度之比，此時(shí)上式就可改寫(xiě)成：就可改寫(xiě)成：式中式中A0和和AX分別是從標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液中分離出來(lái)的分別是從標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液中分離

21、出來(lái)的等重量物質(zhì)的放射性強(qiáng)度。由于該法只要根據(jù)同位素稀釋等重量物質(zhì)的放射性強(qiáng)度。由于該法只要根據(jù)同位素稀釋前后分出樣品的放射性強(qiáng)度之比就能求得待測(cè)物的含量，前后分出樣品的放射性強(qiáng)度之比就能求得待測(cè)物的含量，此法的靈敏度可以大大提高。此法的靈敏度可以大大提高。通常通常A0AX，所以，所以51 當(dāng)溶液中金屬離子的含量相對(duì)于反應(yīng)劑來(lái)說(shuō)是過(guò)量的，反當(dāng)溶液中金屬離子的含量相對(duì)于反應(yīng)劑來(lái)說(shuō)是過(guò)量的，反應(yīng)劑將全部與金屬離子作用。因此，只要向標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)應(yīng)劑將全部與金屬離子作用。因此，只要向標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液中加入完全相等的亞化學(xué)計(jì)量反應(yīng)劑，經(jīng)過(guò)同樣的化學(xué)溶液中加入完全相等的亞化學(xué)計(jì)量反應(yīng)劑，經(jīng)過(guò)同樣的化學(xué)

22、分離方法就可分離出等量的金屬離子。溶劑萃取，離子交換，分離方法就可分離出等量的金屬離子。溶劑萃取，離子交換，沉淀，電解，吸附等方法均可用作亞化學(xué)計(jì)量法的分離方法。沉淀，電解，吸附等方法均可用作亞化學(xué)計(jì)量法的分離方法。其中萃取法最為常用。其中萃取法最為常用。 例如：實(shí)驗(yàn)用銦的放射性同位素例如：實(shí)驗(yàn)用銦的放射性同位素113mIn作為示蹤原子，用作為示蹤原子，用標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定銦作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而求出未知穩(wěn)定銦溶液的濃度。標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定銦作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而求出未知穩(wěn)定銦溶液的濃度。由于由于8-羥基喹啉與銦在羥基喹啉與銦在pH3-5時(shí)定量反應(yīng)，生成的時(shí)定量反應(yīng)，生成的8-羥基喹羥基喹啉銦溶于氯仿，因此，用亞化學(xué)計(jì)量的啉銦溶于氯仿，因此，用亞化學(xué)計(jì)量的8-羥基喹啉羥基喹啉-氯仿溶液氯仿溶液定量萃取部分銦，再測(cè)量放射性。作定量萃取部分銦，再測(cè)量放射性。作AX對(duì)對(duì)1/WX圖，從圖中圖，從圖中可查出未知液中銦的含量?？刹槌鑫粗褐秀煹暮?。（四） 衍生物同位素稀釋法：