人類重要傳染病病原體耐藥機制的基礎(chǔ)研究

1、項目名稱：人類重要傳染病病原體耐藥機制的基礎(chǔ)研究首席科學(xué)家：王明貴 復(fù)旦大學(xué)起止年限：依托部門：教育部18 / 18文檔可自由編輯打印一、研究內(nèi)容擬解決的科學(xué)問題：鑒于我國在重大傳染病的分子傳播規(guī)律、耐藥產(chǎn)生機制研究上的滯后，本課題所要解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是：建立系統(tǒng)的耐藥病原體分子監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)與完整的反映中國耐藥情況的耐藥基因譜，系統(tǒng)地了解新耐藥基因或耐藥位點的產(chǎn)生與演變規(guī)律，明確主要耐藥機制，獲得治療重要傳染病耐藥的新途徑。1. 建立系統(tǒng)的耐藥病原體分子監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)與完整的反映中國耐藥情況的耐藥基因譜：分子流行病學(xué)作為一種新的研究方法研究傳染病病原體的傳播規(guī)律，在西方發(fā)達國家已經(jīng)廣泛應(yīng)用，并已經(jīng)取得

2、很好的成果。但是病原體流行病學(xué)的傳播規(guī)律因地而異，國外的研究成果不能完全適用于我國，解釋我國的傳染病病原體及其耐藥性的流行情況，更不可能用于指導(dǎo)我國傳染病及其病原體耐藥性的防治工作。因此，建立我國耐藥菌的分子耐藥監(jiān)測平臺，應(yīng)利用現(xiàn)代分子流行病學(xué)的手段，研究我國耐藥病原體的產(chǎn)生機制與傳播規(guī)律，在此基礎(chǔ)上建立耐藥傳播的預(yù)警機制與控制策略。2. 系統(tǒng)地了解新耐藥基因或耐藥位點的產(chǎn)生與演變規(guī)律，明確主要耐藥機制： 細菌方面，著重研究近年來新出現(xiàn)的嚴重的銅綠假單胞菌對碳青霉烯類耐藥的形成機制，近年來新發(fā)現(xiàn)的大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機制、ESBL編碼基因的來源及傳播機制，這些內(nèi)容在國際上均

3、尚未進行深入研究。我國耐藥結(jié)核分枝桿菌新耐藥基因變異位點研究，對新耐藥機制進行深入的研究，指導(dǎo)我國耐藥結(jié)核分枝桿菌感染的診斷與防治。在上述分子流行病學(xué)及耐藥機制研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用分子生物學(xué)信息技術(shù)，直接從臨床標本中檢測細菌及結(jié)核分枝桿菌，同時檢測其耐藥性。大大縮短病原體及其耐藥性的病原診斷時間，指導(dǎo)臨床及時、有效地選用藥物。HBV耐藥機制的研究包括HBV對核苷類耐藥規(guī)律、宿主因素對治療效果的影響及HBV新突變株生物學(xué)特性的研究，建立可靠的HBV體外監(jiān)測系統(tǒng)。HIV耐藥基因突變與耐藥特性間的定性和定量關(guān)系，耐藥的生物學(xué)特性，為建立使用高靈敏度、高通量的基因型測定準確預(yù)測耐藥特性提供依據(jù)，同時對抗

4、HIV靶位HIV逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)和功能的進行研究。3. 獲得治療重要傳染病耐藥的新途徑：耐藥病原體感染的治療措施有限、病死率高，通過耐藥真菌新藥靶的篩選及新型藥物的篩選、抗菌藥物防突變濃度研究、抗病毒藥聯(lián)合抗HBV等研究，探尋對付耐藥病原體的新途徑。開展耐藥HIV病毒與相關(guān)細胞因子并重的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，以側(cè)重病毒分子變異能力以外的機制包括細胞靶位的新路線解決HIV耐藥的新途徑。本研究的最終目標為阻止或延緩傳染病病原體耐藥性的產(chǎn)生及傳播，有效治療耐藥病原體的感染，提高傳染病的治愈率，增進人類健康水平。這也是本研究要解決的最根本問題。主要研究內(nèi)容：本研究項目包括重要傳染病的5種主要病原體：細菌、結(jié)核分

5、枝桿菌、人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒及白色念珠菌。各病原體的研究內(nèi)容包括耐藥性的分子流行病學(xué)、耐藥性的形成及傳播機制（包括新耐藥基因的研究）、耐藥菌的快速診斷、耐藥菌感染的預(yù)防與治療新途徑等方面。1細菌耐藥機制及耐藥性防治（1）多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機制通過對碳青霉烯酶、膜通透性改變及主動外排機制3方面的較全面的研究，明確多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機制。國內(nèi)近年研究發(fā)現(xiàn)在銅綠假單胞菌中存在一種能水解亞胺培南但活性又能被氯唑西林抑制的酶（類似于AmpC酶但水解底物輪廓擴大包括了碳青霉烯類抗生素），因此極可能存在新的碳青霉烯酶及其它耐藥機制同時參與，計劃對具新特性的內(nèi)酰胺酶進行進一步的研究，

6、預(yù)期會有新的發(fā)現(xiàn)。（2）大腸埃希菌耐藥機制研究1）大腸埃希菌對喹諾酮類的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機制研究：計劃對大腸埃希菌對喹諾酮類的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機制進行深入研究，研究內(nèi)容包括：質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因qnrA及qnrB分子流行情況，明確質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機制在喹諾酮類耐藥性形成中的作用。耐藥機制研究：qnr產(chǎn)物Qnr蛋白對喹諾酮作用靶位的保護作用、Qnr作用位點和Qnr蛋白的模建及晶體結(jié)構(gòu)的研究，明確耐藥的形成機制。2）大腸埃希菌等革蘭陰性桿菌CTXM型ESBLs的傳播機制及傳播規(guī)律：計劃在原有基礎(chǔ)上作進一步深入的研究，研究CTXM編碼基因的起源及其傳播規(guī)律，從而有利于耐藥菌的控制。（3）建立耐藥菌快速基因診斷方法采

7、用分子生物信息學(xué)技術(shù)，研究病原菌的基因組序列或特征性基因序列和耐藥基因序列，目標是建立多重DNA引物的反應(yīng)模式，在鑒別革蘭陽性和革蘭陰性菌的主要菌種的同時，測定耐藥譜。采用分子生物學(xué)方法直接從人體體液或相關(guān)標本中檢測細菌的特異性DNA，從而建立快速、準確的病原菌診斷方法。（4）建立常用抗菌藥治療各種重要病原菌的“防突變濃度”范圍通過建立體外模型測定常用各類抗菌藥對重要病原菌的防突變濃度（mutant-prevention concetration，MPC）和“突變選擇窗”，即建立不同抗菌藥對不同細菌的防突變濃度范圍及“突變選擇窗”，據(jù)此制訂或調(diào)整抗菌治療方案，達到提高治愈率，減少耐藥菌產(chǎn)生的目

8、的。2. 耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學(xué)及耐藥機制（1）建立先進的分子流行病學(xué)方法著重于闡明一線抗結(jié)核藥物和主要二線抗結(jié)核藥物的耐藥株基因突變頻率及中國流行耐藥株突變特點、國內(nèi)主要結(jié)核桿菌耐藥株的優(yōu)勢菌群，耐藥結(jié)核菌群的流行區(qū)域、流行趨勢及范圍，分析耐藥菌群的種類、分布、分子流行病學(xué)特征。同時，以某一研究地區(qū)（如上海）為研究場地建立示范性分子流行病學(xué)預(yù)警以及快速鑒定耐藥傳播（內(nèi)源性或外源性）模式的平臺，選用有價值的分子流行病學(xué)標記，如IS6110為基礎(chǔ)的DNA指印技術(shù)、間區(qū)寡核苷酸分型（spoligtyping）、分枝桿菌散在重復(fù)序列（mycobacterial interspersed re

9、petitive unit， MIRU）,富含GC的多態(tài)性（polymorphic GC-rich sequence，PGRS）等項技術(shù)為基礎(chǔ)進行聚類分析，分析比較耐藥簇菌株和非耐藥簇菌株的差異，確定近期外源性感染的作用，揭示耐藥結(jié)核病的傳播規(guī)律如易發(fā)病的高危人群、傳播場所以及其它影響傳播的危險因子。（2）描繪完整的我國結(jié)核病耐藥基因譜，發(fā)現(xiàn)新的耐藥機制在結(jié)核分子流行病學(xué)研究基礎(chǔ)上繪制能對我國臨床診斷與防治提供指導(dǎo)意義的耐藥基因譜，對相應(yīng)的耐藥機制作出研究。對于未發(fā)現(xiàn)當前報道的耐藥基因的菌株，擬以基因芯片與蛋白質(zhì)組學(xué)方法尋找差異基因與差異蛋白，定位新的耐藥基因或發(fā)現(xiàn)新的耐藥機制。（3）建立符合

10、我國耐藥現(xiàn)狀與國情的快速分子藥敏檢測系統(tǒng)結(jié)核耐藥性的快速鑒定對結(jié)核病的早期診斷、鑒別診斷、個體化的有效化療和控制傳播都有極其重要的意義。我們將建立基于我國結(jié)核病耐藥基因譜以及耐藥機制研究基礎(chǔ)上的快速分子藥敏檢測系統(tǒng)，并研究基因型耐藥與表型耐藥的相關(guān)性，用前瞻性方法指導(dǎo)臨床用藥，評估基因型耐藥快速檢測的臨床價值。3. HIV耐藥性分子流行病調(diào)查和耐藥機制研究（1）HIV耐藥性的分子流行病學(xué)研究利用已有的全國HIV耐藥性調(diào)查網(wǎng)絡(luò)開展未接受HIV抗病毒治療和治療后人群和治療地區(qū)的耐藥性流行病學(xué)調(diào)查，耐藥毒株出現(xiàn)的情況以及影響因素分析在我國艾滋病高發(fā)區(qū)開展HIV耐藥性的分子流行病學(xué)研究，對接受國家免費

11、抗病毒治療人群通過套式PCR擴增HIV蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因并進行序列測定，將測得序列進行分析與國際HIV耐藥數(shù)據(jù)庫進行比對和分析,得出治療人群HIV的耐藥突變基本資料，包括其類型、人群分布和發(fā)生發(fā)展規(guī)律。確定HIV的基因亞型，并研究不同病毒亞型與耐藥性的關(guān)系。（2）HIV耐藥機制研究從測定到的含各類耐藥突變HIV毒株的病人分離病毒，經(jīng)體外藥敏試驗確定HIV耐藥突變株基因型與表型間的關(guān)系。同時對HIV野毒株加以不同濃度的相關(guān)藥物壓力篩選出相應(yīng)的耐藥株，研究HIV與藥物的相互作用，以探討HIV耐藥株的出現(xiàn)與藥物濃度，用藥劑量與病毒復(fù)制抑制間的關(guān)系。了解耐藥毒株的基因變異特點，確定我國HIV流行株的

12、耐藥株類型，基因型及表型的特點。研究耐藥病毒株的適應(yīng)性，結(jié)合其在體內(nèi)存在情況，探討其在人群中傳播的潛在危險性。（3）HIV逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)和功能的研究運用分子生物學(xué)和X-射線結(jié)晶學(xué)方法開展與艾滋病藥物相關(guān)的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)和功能的研究，在分子水平研究耐藥性形成機制，研究包括病毒的和與之復(fù)制和變異相關(guān)的細胞組分和分子間的相互作用及其影響因素。（4）建立綜合性HIV耐藥數(shù)據(jù)庫結(jié)合耐藥分子流行病調(diào)查、體外耐藥實驗測試和HIV酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)和其與細胞組分和分子的相互作用的研究結(jié)果，建立綜合性HIV耐藥數(shù)據(jù)庫，采用多因素分析方法，確定我國不同HIV耐藥基因型和表型間的關(guān)聯(lián)特點，預(yù)測我國抗HIV治療中的耐藥

13、出現(xiàn)頻率和強度，提出我國抗HIV治療中減少HIV耐藥毒株出現(xiàn)的藥物配伍、劑量調(diào)整和方案改進的科學(xué)建議，提出針對耐藥HIV毒株的新的抗HIV藥物的新設(shè)計方案和新技術(shù)路線。4. 乙型肝炎病毒的耐藥機制（1）核苷類似物對HBV的耐藥規(guī)律及其天然無應(yīng)答性的原因擬對國內(nèi)/國際臨床驗證和臨床抗病毒治療的病人系列標本，采用PCR擴增產(chǎn)物直接測序和/或克隆后測序的方法，以及高靈敏度單一基因分子點突變檢測技術(shù)（detection of base substitution on a single molecule，DBSSM），對比治療前和發(fā)生臨床耐藥時DNA序列結(jié)果，尋找與臨床耐藥有關(guān)的變異位點及其規(guī)律。對已確

14、定的單一耐藥位點變異，課題組已建立聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段多態(tài)性分析法（PCR-RFLP）、實時熒光PCR法檢測，分析其發(fā)生、發(fā)展、與臨床耐藥病情的關(guān)系。（2）HBV變異序列特異性細胞免疫反應(yīng)的研究目前國內(nèi)外對變異耐藥發(fā)生后為何出現(xiàn)不同臨床結(jié)局缺乏系統(tǒng)的研究，為何同為出現(xiàn)YMDD突變的患者, 一些肝病變加重甚至肝功失代償死亡，而另一些肝功能可完全正常？核苷類似物治療發(fā)生YMDD突變且病情加重者是由于機體免疫應(yīng)答的不同還是有更重要的HBV突變？初步研究顯示HBV耐藥突變后“表位漂移”及“免疫顯性消長”可能是影響HBV耐藥不同應(yīng)答轉(zhuǎn)歸的重要機制。本課題計劃對此進行深入的研究。（3）對導(dǎo)致干擾素抗病毒

15、治療失敗的宿主因素進行分析干擾素用于慢乙肝抗病毒治療也已近二十年時間，為什么在相同基因型、重要位點變異情況相似的情況下，臨床抗病毒療效差異懸殊，抵抗干擾素治療的機制也待闡明，我們以往和國外的一些研究工作曾就HBV基因型以及其他位點的基因變異對干擾素抗病毒療效的影響進行分析，雖發(fā)現(xiàn)一些可能相關(guān)的原因，但結(jié)果尚不能令人滿意。本課題將從宿主遺傳因素的角度進一步探討導(dǎo)致HBV抵抗干擾素治療的機制。（4）建立并優(yōu)化乙肝病毒表型耐藥及藥敏實驗的體外鑒定系統(tǒng)國外已經(jīng)開始利用體外藥敏系統(tǒng)來協(xié)助臨床醫(yī)生選擇抗病毒藥物。如體外實驗發(fā)現(xiàn)阿德福韋對YMDD變異株有明顯的抑制作用，臨床試驗結(jié)果也證實了這一結(jié)果，而對阿德

16、福韋產(chǎn)生耐藥的乙肝病毒N236T變異在體外試驗中仍對拉米夫定敏感，IC50的改變3.5倍。目前國內(nèi)在基因耐藥檢測技術(shù)方面發(fā)展較快，已建立基因芯片、Real-TimePCR、RFLP等方法，但在病毒藥敏檢測系統(tǒng)方面還未見報道，主要原因是該系統(tǒng)涉及技術(shù)較復(fù)雜。我們計劃建立并優(yōu)化乙肝病毒表型耐藥及藥敏實驗的體外鑒定系統(tǒng)，以用于研究重要的HBV耐藥突變株的生物學(xué)功能，如在中國發(fā)現(xiàn)的rtG172E，rtG174C和rtG172E/rtG174C三種新變異株，包括體外復(fù)制能力、交叉耐藥性等。同時，體外藥物敏感性檢測系統(tǒng)可以為臨床醫(yī)生合理處理耐藥病毒感染提供強有力的依據(jù)。5白色念珠菌耐藥機制研究（1）白色念

17、珠菌耐藥性的分子流行病學(xué)研究建立真菌庫，測定各菌株對各類抗真菌藥物的敏感性，并重點研究氟康唑作用靶酶基因CYP51和多藥耐藥蛋白基因CDR1、MDR1，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TAC1、CAP1基因的表達差異；從中選擇不同來源的白色念珠菌耐藥株及其親本菌，通過基因測序，分析CYP51和TAC1、CAP1基因的序列變異特點，發(fā)現(xiàn)耐藥優(yōu)勢變異；比較我國與國外耐藥變異的差異，總結(jié)我國白色念珠菌耐藥變異的特點及分布規(guī)律，并分析我國特有的耐藥變異類型及形成原因。（2）白色念珠菌耐藥相關(guān)新基因功能及耐藥性形成機制研究研究耐藥株及其親本菌的基因組和蛋白質(zhì)組表達改變特點，發(fā)現(xiàn)新的耐藥相關(guān)基因；構(gòu)建新發(fā)現(xiàn)的白色念珠菌耐藥相

18、關(guān)基因的缺失菌和高表達菌，通過考察藥物敏感性、耐藥性形成、生物膜形成、菌絲形成、藥物外轉(zhuǎn)運、靶酶活性、基因表達調(diào)控、生長周期及其他相關(guān)基因表達等表型的差異，明確新發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)基因在耐藥性形成中的作用。分離、純化蛋白，分析蛋白的功能。（3）抗白色念珠菌耐藥性新途徑研究利用白色念珠菌耐藥株，篩選抗耐藥白色念珠菌藥物，或與氟康唑聯(lián)合篩選，尋找氟康唑增敏劑；利用高表達含關(guān)鍵變異位點的耐藥基因（CYP51、TAC1、CAP1）的白色念珠菌，篩選抗耐藥白色念珠菌藥物或抗真菌藥物增敏劑。二、預(yù)期目標總體目標：1. 對我國重要傳染病病原體的分子流行病學(xué)情況及耐藥性進化規(guī)律有一個較全面的了解，從而有助于制訂方

19、案，防治耐藥性的產(chǎn)生與傳播。2. 明確重要病原體包括結(jié)核分枝桿菌、細菌、HIV、HBV及白色念珠菌對主要抗感染藥物的耐藥機制、耐藥規(guī)律，以及耐藥性的形成及傳播機制。3. 發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因或基因突變位點，提升我國的醫(yī)學(xué)科研水平和在國際的影響力。4. 探索治療耐藥病原微生物的新途徑如耐藥真菌及HIV新藥及/或新藥靶的篩選等。5. 建立一支具我國特色的病原體耐藥機制研究的科研隊伍，培養(yǎng)一批中青年科研骨干。五年預(yù)期目標1. 理論方面：（1）通過重要傳染病病原體的分子流行病學(xué)的研究，了解我國傳染病病原體耐藥性的形成及傳播規(guī)律，如可明確耐藥結(jié)核分枝桿菌感染是否以外源性感染為主，豐富理論知識，指導(dǎo)耐藥性防治

20、。（2）通過對傳染病重要病原體對主要抗菌藥物及抗病毒藥物的耐藥機制的研究，特別是對新耐藥機制的研究，可發(fā)現(xiàn)一些新的耐藥基因或基因變異，充實耐藥機制理論，如細菌對喹諾酮類抗菌藥的耐藥性也可由質(zhì)粒介導(dǎo)。（3）通過對抗耐藥性新途徑的探索性研究，可能會獲得創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)如篩選有治療意義的耐藥真菌及抗HIV的新藥靶、新藥物，為耐藥病原體的治療開辟新途徑。2. 方法與技術(shù)方面：（1）建立MIRIU、PGRS等方法，進行結(jié)核分枝桿菌的聚類分析，確定耐藥菌的來源。（2）與國外有關(guān)單位合作建立方法，以合成肽刺激體系及Tetramer制備技術(shù)用于HBV耐藥機制的研究。（3）在國內(nèi)首次建立HBV表型及藥敏測定方法。（4

21、）建立高靈敏度的單一基因分子點突變檢測技術(shù)（DBSSM）測定HIV、HBV基因序列變異，提高檢測水平。3. 科研隊伍建設(shè)方面：（1）建立一支具我國特色的病原體耐藥機制研究的科研隊伍、密切各科研單位的團結(jié)、協(xié)作精神，進一步提升我國的科研水平。（2）培養(yǎng)100名左右具備現(xiàn)代分子生物學(xué)知識的病原體耐藥性及耐藥機制研究的碩士、博士研究生。（3）每年在SCI收錄的國際刊物上發(fā)表高質(zhì)量的科研論文20篇以上，提升我國科研工作者在全球的地位。三、研究方案總體設(shè)計思路按傳染病的常見病原體：細菌、結(jié)核分枝桿菌、人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒及真菌設(shè)置5個課題。各課題研究內(nèi)容包括耐藥性的分子流行病學(xué)、耐藥機制及耐藥

22、性的形成及傳播機制（包括新耐藥基因的研究）、抗耐藥性的新途徑等方面。本項目的承擔單位為國內(nèi)在病原體耐藥性研究方面具良好基礎(chǔ)的科研單位，其中包括數(shù)個國家或部委重點實驗室。因上述5個病原體的培養(yǎng)條件、生長特性、抗感染藥物的使用及耐藥性特點等方面均截然不同，各研究者及多數(shù)實驗室均僅對上述某一個或二個病原體具良好的工作基礎(chǔ)，故按病原體來設(shè)置課題具較好的可操作性。人類重要傳染病病原體結(jié)核分枝桿菌細 菌真 菌乙型肝炎病毒（HBV）人類免疫缺陷病毒（HIV）（HBV）課題一 細菌耐藥機制及其耐藥性防治研究研究課題二 耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學(xué)及耐藥機制課題五 白色念珠菌耐藥機制研究課題三 我國艾滋病病毒

23、耐藥性分子流行病調(diào)查和耐藥機制研究課題四 乙型肝炎病毒的耐藥機制研究病原體耐藥機制基因變異及/或新基因研究病原體分子流行病學(xué)研究抗耐藥性的新途徑研究分析重要病原體耐藥性產(chǎn)生的主要機制、影響因素，尋找抗耐藥新途徑制訂方案，有效控制重要傳染病的耐藥傳染源制訂發(fā)÷課題間的有機聯(lián)系以及與預(yù)期目標的關(guān)系各課題間聯(lián)系密切：細菌、結(jié)核分枝桿菌、人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒及真菌均為傳染病的主要病原體，只有對5個病原體的耐藥機制進行全面研究，才能了解傳染病病原體的耐藥全貌及共性，達到控制耐藥性的目標；每個病原體均包含耐藥性的分子流行病學(xué)、耐藥機制及抗耐藥性的新途徑等方面研究內(nèi)容；研究目標相同，均是

24、通過病原體耐藥性及耐藥機制的研究，最終阻止或延緩耐藥性的產(chǎn)生與傳播，提高傳染病的治愈率。課題一 細菌耐藥機制及其耐藥性防治研究主要研究內(nèi)容：銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制、大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機制及CTXM型ESBL的來源及傳播機制、耐藥菌的快速診斷及預(yù)防耐藥性發(fā)生研究。目標：明確近年來新出現(xiàn)的細菌耐藥性的形成和傳播機制，及時、有效地控制耐藥菌感染及耐藥性的傳播。承擔單位：復(fù)旦大學(xué) 負責人 王明貴（教授、博士），主要學(xué)術(shù)骨干：張嬰元（教授、博導(dǎo)）、朱德妹（教授、博導(dǎo)）張菁（副教授、碩士）。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院：主要學(xué)術(shù)骨干：俞云松（教授、博導(dǎo)）周志慧（副教授、博士）、陳

25、亞崗（教授、博導(dǎo)）經(jīng)費比例：37。課題二 耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學(xué)及耐藥機制研究主要研究內(nèi)容：我國耐藥結(jié)核病分子流行病學(xué)特征及傳播模式、我國主要抗結(jié)核藥物耐藥基因譜的繪制、新耐藥基因及耐藥機制、耐藥基因型與表型的相關(guān)性以及快速基因藥敏診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用評估。目標：明確我國耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學(xué)特征及耐藥基因譜，有效控制耐藥結(jié)核病。承擔單位：復(fù)旦大學(xué) 負責人 張文宏（副教授、博士）主要學(xué)術(shù)骨干：翁心華（教授、博導(dǎo)）、高謙(教授、博士)楊燕萍 (講師、博士) 中科院上海生命科學(xué)院 張穎（研究員，兼美國約翰霍普金斯大學(xué)布隆博格公共衛(wèi)生學(xué)院副教授）經(jīng)費比例：27。課題三 我國艾滋病病毒耐

26、藥性分子流行病調(diào)查和耐藥機制研究主要研究內(nèi)容：HIV耐藥性分子流行病學(xué)研究，建立使用高靈敏度、高通量的基因型測定準確預(yù)測耐藥特性，分析HIV逆轉(zhuǎn)錄酶與核苷酸類似物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能，及其與細胞相關(guān)因子的分子作用機制，以HIV-1 RT的結(jié)構(gòu)解析為基礎(chǔ)提出對抗HIV耐藥株的新靶位，包括細胞靶位并設(shè)計出1-2種新型抗病毒藥物，通過本研究提出我國艾滋病治療臨床藥物的選擇、臨床治療方案的調(diào)整和進一步優(yōu)化方式。目標：系統(tǒng)地開展HIV耐藥性流行病學(xué)調(diào)查和耐藥機制的研究，為艾滋病治療提供新的抗耐藥性途徑，最終提出避免或減少HIV耐藥的出現(xiàn)和流行的新途徑。承擔單位：中國疾病預(yù)防控制中心 負責人 邵一鳴（研究員

27、、博士）主要學(xué)術(shù)骨干：張曉燕（副研究員、博士）、馬麗英（副研究員）、袁霖（助理研究員） 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院 主要學(xué)術(shù)骨干：丁建平(研究員、博士)張美蘭（副研究員）、祁維平（助理研究員） 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 主要學(xué)術(shù)骨干：高峰（教授、博士）魯鳳民（副教授），史宇暉（講師，博士）經(jīng)費比例：15。課題四 乙型肝炎病毒的耐藥機制主要研究內(nèi)容：核苷類似物對HBV的耐藥規(guī)律及其天然無應(yīng)答性的原因、HBV變異序列特異性細胞免疫反應(yīng)的研究、對導(dǎo)致干擾素抗病毒治療失敗的宿主因素進行分析、建立并優(yōu)化乙肝病毒表型耐藥及藥敏實驗的體外鑒定系統(tǒng)、臨床HBV耐藥監(jiān)測系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)的建立。目標：通過對HBV耐藥規(guī)律的研究

28、、耐藥監(jiān)測系統(tǒng)的建立，提高抗HBV藥物的臨床療效。承擔單位：上海第二醫(yī)科大學(xué) 負責人 張欣欣（教授、博士） 主要學(xué)術(shù)骨干：陸志檬（教授、博導(dǎo)）、龔啟明（副教授） 南方醫(yī)科大學(xué) 主要學(xué)術(shù)骨干：溫淑娟（副教授）王戰(zhàn)會（助理研究員） 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 莊輝（教授，院士），李彤（副教授） 李杰（副教授）經(jīng)費比例：13。課題五 白色念珠菌耐藥機制研究主要研究內(nèi)容：通過分子流行病學(xué)調(diào)查，耐藥菌株基因變異分析，明確我國白色念珠菌耐藥變異的特點及規(guī)律；應(yīng)用基因表達譜芯片雜交和蛋白質(zhì)二維電泳技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)新的白色念珠菌耐藥相關(guān)基因；通過相關(guān)基因缺失菌和高表達菌的表型分析，分析白色念珠菌耐藥

29、相關(guān)基因功能，并進一步闡明白色念珠菌耐藥機制；利用白色念珠菌耐藥株和耐藥基因高表達優(yōu)勢變異株，篩選抗耐藥白色念珠菌新化合物。目標：明確我國耐藥白色念珠菌的分子流行病學(xué)特征及耐藥變異特點；研究新的白色念珠菌耐藥相關(guān)基因及其功能，進一步闡明白色念珠菌耐藥機制；建立有效篩選抗耐藥白色念珠菌新化合物的模型。承擔單位：中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué) 負責人 姜遠英（教授、博導(dǎo)） 主要學(xué)術(shù)骨干：顧 軍（教授、博導(dǎo)）、曹永兵(講師、博士)經(jīng)費比例：8%技術(shù)路線1. 細菌耐藥機制及耐藥性防治（1）多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機制 通過對碳青霉烯酶、膜通透性改變及主動外排機制的研究，明確多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機制

30、，對新發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶進行進一步的研究。 1）碳青霉烯酶的研究：通過對碳青霉烯酶的篩選、酶特性及基因型分類等研究，了解產(chǎn)酶在耐藥性形成中的作用，與國外資料比較，了解國內(nèi)細菌產(chǎn)碳青霉烯酶特性；對新基因型進行基因定位（質(zhì)?；蛉旧w）、克隆表達、酶動力學(xué)等研究。 2）膜通透性研究：以聚丙烯胺凝膠電泳（SDSPAGE）方法分析外膜孔蛋白的情況，與敏感株比較，闡明外膜蛋白在碳青霉烯類抗生素耐藥形成中的作用。 3）主動外排系統(tǒng)的研究：采用CCCP抑制試驗及外排泵調(diào)控基因PCR擴增及序列分析方法明確外排表達狀況。（2）大腸埃希菌耐藥機制研究1）大腸埃希菌對喹諾酮類的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機制研究：質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因qn

31、rA及qnrB分子流行情況：檢測gnr在患者臨床分離株、健康人腸道、家禽、家畜腸道中的分布，明確質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥機制在喹諾酮類耐藥性形成中的作用。耐藥機制研究：qnr產(chǎn)物Qnr蛋白對喹諾酮作用靶位DNA旋轉(zhuǎn)酶A、B亞基的保護作用、Qnr作用位點和Qnr蛋白的模建及晶體結(jié)構(gòu)的研究，明確這一近年來發(fā)現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象的形成機制。2）大腸埃希菌等革蘭陰性桿菌CTXM型ESBLs的傳播機制及傳播規(guī)律：國內(nèi)的ESBL以CTXM型為主，通過對編碼基因周圍DNA的分析、比較，了解編碼基因的起源及其傳播規(guī)律。（3）建立耐藥菌快速基因診斷方法采用分子生物信息學(xué)技術(shù)，研究病原菌的基因組序列或特征性基因序列，種屬的保守區(qū)序列

32、，致病基因和耐藥基因序列或特征性的基因序列等，如16SrRNA，23SrRNA，16SrRNA23SrRNA基因區(qū)間的基因序列差異等。目標是建立多重DNA引物的反應(yīng)模式，可鑒別革蘭陽性和革蘭陰性菌的主要菌種;同時可以識別主要的耐藥基因以及重要的耐藥基因組DNA片斷，以進行耐藥譜的測定，進而采用分子生物學(xué)方法直接從人體體液或相關(guān)標本中檢測細菌的特異性DNA，從而建立快速、準確的病原菌診斷方法。（4）建立常用抗菌藥治療各種重要病原菌的“防突變濃度”范圍：擬采用體外模型測定抗菌藥測定金葡菌、肺炎鏈球菌和銅綠假單胞菌的MPC和“突變選擇窗”，據(jù)此改進現(xiàn)有的給藥方案，達到提高治愈率，減少耐藥菌產(chǎn)生的目的

33、。2. 耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學(xué)及耐藥機制（1）我國耐藥結(jié)核病分子流行病學(xué)特征及傳播模式的研究擬對我國華北與華東地區(qū)近10年來的結(jié)核初發(fā)病人菌株庫進行DNA指紋分析，同時對這些出發(fā)病人的耐藥狀況進行鑒定，對主要抗結(jié)核藥物耐藥菌株的主要耐藥基因進行鑒定，從而對耐藥的進化特征、聚集性特征和耐藥基因分布特征進行生物信息學(xué)分析。從而給出我國華北與華東地區(qū)近10年來的主要抗結(jié)核藥物耐藥性的進化特征與耐藥基因發(fā)生特征。同時，我們還以華東地區(qū)3個區(qū)縣所有的菌陽結(jié)核病病人（包括涂陽和涂陰病人）作為樣本，利用MIRU和IS6110RFLP的方法鑒定所有菌株的基因型。結(jié)合流行病學(xué)資料，分析結(jié)核病的流行規(guī)律，

34、建立以分子流行病學(xué)方法為基礎(chǔ)的耐藥結(jié)核病傳播的規(guī)律快速鑒定平臺。（2）主要抗結(jié)核藥物耐藥基因譜的繪制及新耐藥基因與耐藥機制的研究在我國華北與華東地區(qū)耐藥菌株分子流行病學(xué)研究基礎(chǔ)上，進行主要耐藥基因篩查，繪制我國耐藥結(jié)核病相關(guān)基因與位點譜，為分子生物學(xué)診斷方法的研制奠定堅實基礎(chǔ)。在篩查過程中發(fā)現(xiàn)當前耐藥機制與耐藥基因不能解釋的耐藥菌株，作為新的耐藥機制與耐藥基因的目標菌株。用DNA芯片方法篩查差異基因，同時還利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法如雙相電泳分析耐藥菌株分泌蛋白和外膜蛋白中的差異性蛋白，通過N-端氨基酸測序和肽質(zhì)譜分析確定蛋白類別。依據(jù)結(jié)核桿菌比較蛋白質(zhì)組分析及轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果，尋找相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，確定OR

35、F框及其在細菌中的分布位置。從而最終發(fā)現(xiàn)新的耐藥相關(guān)蛋白與基因，闡明新的耐藥發(fā)生機制。同時，對一些國外研究尚不深入的藥物耐藥機制進行研究，爭取發(fā)現(xiàn)新的耐藥機制或耐藥基因。最后，采用knockdown等技術(shù)手段，研究所獲得的基因（蛋白）的功能，并初步研究它們作為治療靶標的可能性。（3）耐藥基因型與表型的相關(guān)性以及快速基因藥敏診斷技術(shù)的評估分析結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對7種常用抗結(jié)核藥物（利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素、喹諾酮類和卡那霉素）的耐藥表型和基因型，了解兩者之間的關(guān)系，確定發(fā)生耐藥基因突變的最低抑菌濃度（MIC），進一步闡明耐藥形成機制。以此為基礎(chǔ)建立快速檢測基因型耐藥的方法，

36、采用前瞻性方法進行肺結(jié)核和骨結(jié)核病人的臨床治療對照研究，闡明其臨床應(yīng)用價值，建立耐藥結(jié)核病人個體化的治療方案。評估基因型耐藥快速檢測的臨床應(yīng)用潛力。3. 我國HIV耐藥性分子流行病調(diào)查和耐藥機制研究（1）HIV耐藥性分子流行病學(xué)研究本研究利用已有的全國HIV耐藥性調(diào)查網(wǎng)絡(luò)，隨機抽取計劃用藥者作為監(jiān)測對象，進行用藥前、用藥后每半年，一年、二年的隊列隨訪研究。對所有樣品完成CD4細胞計數(shù)，病毒載量測定；套式PCR擴增HIV基因片斷進行序列測定，運用GCG軟件包、Clustal X、GeneDoc 等序列排列和進化分析工具對測得序列進行分析，并與美國Los Alamos國家實驗室HIV Drug R

37、esistance Database數(shù)據(jù)庫以及Stanford HIV Drug Resistance Database數(shù)據(jù)庫中序列進行比較以得到樣本序列與已知耐藥序列的關(guān)聯(lián)情況；OLA實驗檢測已知與耐藥密切相關(guān)位點是否發(fā)生耐藥突變；以高靈敏度單一基因分子點突變檢測技術(shù)（detection of base substitution on a single molecule，DBSSM）檢測點突變，以最終確定病毒的耐藥基因突變位點，并與國外已有報道相比較，建立適合于我國HIV流行特點的耐藥性檢測技術(shù)和分析方法。同時，通過流行病學(xué)的調(diào)查，確定針對我國HIV流行株的耐藥株類型，基因型及表型的特點。（

38、2）對HIV耐藥性出現(xiàn)、發(fā)展進程與用藥種類和劑量之間的關(guān)系進行研究通過對隨訪調(diào)查及測定樣本的匯總分析，了解我國HIV治療過程中耐藥性出現(xiàn)、發(fā)展進程與用藥種類和劑量之間的關(guān)系；通過體外藥物壓力篩選獲得實驗室耐藥株，研究藥物劑量與耐藥株出現(xiàn)之間的關(guān)系，藥劑量與病毒復(fù)制抑制率之間的關(guān)系；結(jié)合現(xiàn)場調(diào)查的數(shù)據(jù)，推測體內(nèi)用藥劑量，為當?shù)匾痪€藥物選擇、臨床治療方案的及時調(diào)整提供意見。在用藥過程中測定用藥前后多個耐藥相關(guān)突變位點在耐藥病毒株中的分布，并進行突變位點的連鎖分析 （linkage analysis），進而確定病毒重組是否與多重耐藥病毒的產(chǎn)生有關(guān)。由于單一耐藥基因在病人治療前就已存在，本研究可回答在

39、多種藥物治療的選擇壓力下，是否不同的單一耐藥病毒發(fā)生重組，從而產(chǎn)生攜帶多種耐藥突變的重組病毒的問題。（3）野生型和突變型HIV-1 RT的結(jié)構(gòu)和功能研究1）HIV-1 RT與核苷酸類似物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能研究研究HIV-1 RT/DNA在與核苷酸類似物（如AZT、3TC、PMEA等）結(jié)合狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，深入了解HIV-1 RT催化的DNA聚合的機理，獲得在此復(fù)合物條件下這些藥物與它們相應(yīng)分子靶標的相互作用的信息。同時，對于對核苷類似物有抗性的HIV-1 RT突變體的結(jié)構(gòu)解析還將使我們對抗藥性產(chǎn)生的機理有所了解。2）HIV-1 RT系列突變體的結(jié)構(gòu)解析以及它們與抗病毒藥物結(jié)合狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和功能研究

40、通過野生型和本研究所獲得的對核苷類似物及非核苷藥物有抗性突變的HIV-1 RT的結(jié)構(gòu)研究，獲得更多的突變型HIV-1 RT及其與抗病毒藥物復(fù)合物的的結(jié)構(gòu)，在三維結(jié)構(gòu)水平上為我們揭示結(jié)構(gòu)與活性間的關(guān)系以及藥物抗性產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而通過對最有效的抗病毒藥物產(chǎn)生抗性的突變型HIV-1 RT在藥物結(jié)合狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)解析，以期設(shè)計不易導(dǎo)致抗藥性同時對已有抗藥性的突變型HIV-1 RT高度有效的新藥物。（4）以HIV-1 RT的結(jié)構(gòu)解析為基礎(chǔ)的新型抗病毒藥物的設(shè)計和最佳用藥組成、抗耐藥性途徑研究通過分離獲得的耐藥毒株及序列分析結(jié)果找出病毒基因變異特點，結(jié)合非核苷酸抑制物結(jié)合狀態(tài)下的HIV-1 RT的結(jié)構(gòu)研究

41、為我們詳細揭示抑制物結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)、各種抑制物的特點與性質(zhì)以及抑制物與形成抑制物結(jié)合口袋的氨基酸的相互作用方式。通過最大限度地增強藥物與HIV-1 RT的保守區(qū)域間的相互作用設(shè)計新藥將可以最大限度地降低這些藥物導(dǎo)致抗藥性的可能。所有已有的核苷酸類似物藥物都有一個共同的特點，即都有一個缺少3-OH基團的糖基，而此3-OH基團在DNA聚合中對于引入下一個核苷酸是至關(guān)重要的。新藥設(shè)計中，我們可以對這些核苷酸類似物的其他的一些引起功能組分進行修飾，如可以對糖基上的其他基團進行修飾，也可以對堿基、三磷酸基團等進行修飾。以期通過這些新的修飾賦予這些新的核苷酸類似物HIV-1 RT高特異性，與對野生型和有抗

42、性的突變型HIV-1 RT的高效性。以上新藥設(shè)計的研究心得，結(jié)合現(xiàn)場耐藥流行病學(xué)調(diào)查提出減少和避免耐藥性產(chǎn)生的有效途徑，最佳用藥途徑，藥物組成，為我國艾滋病治療政策的制定，臨床藥物的選擇、臨床治療方案的及時調(diào)整提供意見。4乙型肝炎病毒的耐藥機制(1) HBV核苷類似物耐藥發(fā)生規(guī)律的研究選擇接受核苷類似物治療的慢性乙肝患者為研究對象，研究治療前后聚合酶基因突變情況及其與血清生化指標、病毒復(fù)制指標、肝組織病變程度之間的關(guān)系。重點研究那些臨床出現(xiàn)耐藥性表現(xiàn)的患者（如HBV DNA水平上升，轉(zhuǎn)氨酶升高），初步篩選出可能耐藥的患者。選擇上述可能的耐藥患者治療前后血清為研究對象，一步法擴增HBV全基因，轉(zhuǎn)

43、染HepG2細胞系進行病毒藥敏試驗，對比治療前后HBV毒株的藥敏結(jié)果，鑒定得到最終的HBV耐藥毒株。分析以上研究結(jié)果，總結(jié)出我國HBV耐藥毒株的發(fā)生頻率及規(guī)律。(2) HBV變異序列特異性細胞免疫反應(yīng)的研究闡明抗病毒治療相關(guān)HBV耐藥變異是否穿越相關(guān)表位，是否可導(dǎo)致這些T細胞表位（特別是CTL表位）HLA限制性的漂移，是否導(dǎo)致表位免疫顯性的消長變化。表位分子免疫學(xué)特性的變化是否與不同患者抗病毒治療應(yīng)答的差異性相關(guān)。選擇HBV耐藥重要熱點變異序列，設(shè)計含有變異位點的多肽，應(yīng)用合成肽誘導(dǎo)刺激分離培養(yǎng)的PBMC，采用ELISPOT方法區(qū)分各合成肽誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，對可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的合成肽進一步截短

44、，并比較截短肽中的免疫顯性表位，Tetramer 鑒定表位的HLA限制性及其漂移情況，同時進行特異性細胞毒T淋巴細胞試驗。ELISPOT通過定量分析IFN等細胞因子的產(chǎn)量和活化T細胞的比例來顯示某種表位的免疫能力及其變化。大多數(shù)活化后能夠產(chǎn)生IFN等細胞因子的CTL，一般均具有對靶細胞的特異性殺傷活性；但也有一些研究表明，并非所有能分泌IFN的CTL均如此，故必要時應(yīng)分析表位特異性CTL的特異性細胞毒活性。（3）HBV耐藥毒株的生物學(xué)意義及特性在HBV全基因質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，根據(jù)臨床耐藥患者血清中獲得的HBV DNA序列分析的結(jié)果，通過定向點突變，獲得不同的HBV耐藥變異株，體外轉(zhuǎn)染HepG2細胞

45、系，研究其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、各種抗原的表達分泌變化及病毒顆粒包裝情況，以及其他常見位點變異，包括A1896位、BCP等對多聚酶耐藥變異株復(fù)制能力的影響。同時構(gòu)建中國株HBV (B和C基因型)重組桿狀病毒HepG2細胞系統(tǒng)，能編碼不同病毒蛋白的臨床耐藥株和野毒株，以此細胞系統(tǒng)用于耐藥變異株生物學(xué)特性的研究，建立藥物敏感實驗、交叉耐藥試驗和新藥篩查的細胞平臺。表型耐藥測定利用所建立的細胞培養(yǎng)平臺，測定將病毒復(fù)制抑制50%時所需的抗病毒藥物濃度（IC50）。（4）干擾素信號傳導(dǎo)系統(tǒng)對抗病毒療效的影響建立干擾素治療的有應(yīng)答和無應(yīng)答的慢性乙型肝患者EBV轉(zhuǎn)化B淋巴細胞系，同時收入健康對照，體外不同濃度干擾素刺

46、激后用凝膠電泳遷移率（EMSA）試驗測定核轉(zhuǎn)錄因子ISGF-3和GAF，并用實時熒光PCR方法對干擾素誘導(dǎo)的抗病毒蛋白MxA、PKR、OAS1等基礎(chǔ)表達量、病毒刺激后、干擾素誘導(dǎo)下等情況下的表達量進行定量。主要通過干擾素信號傳導(dǎo)途徑異常的分析，就宿主遺傳因素對干擾素治療抵抗的影響進行探討。5. 白色念珠菌耐藥機制研究（1）白色念珠菌耐藥性的分子流行病學(xué)研究1）建立我國白色念珠菌臨床菌種庫及其藥物敏感性數(shù)據(jù)庫，分析CYP51、CDR1、MDR1、TAC1、CAP1的表達差異，明確我國白色念珠菌耐藥性形成的分子特點。2）收集不少于50對白色念珠菌耐藥株及其親本株樣本，用PCR法高保真擴增出CYP5

47、1、TAC1、CAP1基因，測序并與GenBank中基因比對；分析上述基因變異與耐藥性分布和耐藥程度的關(guān)系，尋找靶酶基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因變異與選擇壓力的關(guān)系及常見的關(guān)鍵變異位點。（2）白色念珠菌耐藥相關(guān)新基因功能及耐藥性形成機制研究1）利用基因表達譜芯片雜交、蛋白質(zhì)二維電泳技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，研究上述50對白色念珠菌耐藥株及其親本株的基因和蛋白質(zhì)表達改變，尋找、發(fā)現(xiàn)新的白色念珠菌耐藥相關(guān)基因。2）克隆新耐藥基因，蛋白表達、分離、純化，分析蛋白的功能。3）分別構(gòu)建新發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)基因敲除的白色念珠菌及其高表達菌株，通過考察藥物敏感性、耐藥性形成、生物膜形成、菌絲形成、藥物外排、靶酶活性、基

48、因表達調(diào)控、生長周期及其他相關(guān)基因表達等表型的差異，明確新發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)基因在耐藥性形成中的作用研究。（3）抗白色念珠菌耐藥性新途徑研究1）利用耐藥性白色念珠菌，從化合物庫（第二軍醫(yī)大學(xué)自有）中篩選抗耐藥白色念珠菌的新化合物，或氟康唑、伊曲康唑、兩性霉素B等現(xiàn)有抗真菌藥物的增敏劑。2）以耐藥優(yōu)勢變異白色念珠菌為篩選模型，從化合物庫中篩選抗耐藥優(yōu)勢變異的新化合物3）以CDR1或MDR1高表達的白色念珠菌為篩選模型，從化合物庫中篩選CDR1和MDR1的外排功能抑制劑創(chuàng)新點與特色1. 利用分子流行病學(xué)手段，全面研究我國多種耐藥病原體的耐藥性產(chǎn)生及傳播規(guī)律，通過對我國病原體的耐藥特點、耐藥基因變異及耐

49、藥基因譜情況的掌握，指導(dǎo)耐藥性的防治。2. 對傳染病重要病原體進行數(shù)個全球創(chuàng)新性的耐藥機制研究，如對在我國發(fā)現(xiàn)的新耐藥基因、耐藥突變體進行進一步研究，將使人類對耐藥機制有更深入的認識，充實耐藥機制理論，如明確細菌對喹諾酮類的耐藥性是否也可通過質(zhì)粒介導(dǎo)，解釋耐藥性上升迅速的原因。3. 通過本研究形成一些開創(chuàng)性的科學(xué)學(xué)說，如耐藥結(jié)核菌感染的病原菌來源學(xué)說；HBV耐藥變異可能導(dǎo)致“特異性T細胞表位HLA限制性漂移”學(xué)說等。4. 應(yīng)用分子生物學(xué)手段，進行耐藥菌的快速診斷，提高療效。5. 開創(chuàng)性地進行抗耐藥性的新途徑研究，如在全球率先通過對HIV逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)和功能的研究，篩選新型抗HIV藥物；篩選耐藥真

50、菌的新抗真菌藥物。可行性分析1. 本項目參加單位均為在國內(nèi)有一定名望、甚至在全球有一定影響的實驗室，已經(jīng)作了大量與本課題密切相關(guān)的前期工作，所有參加單位均具有參與重大國家科技計劃如973計劃、科技攻關(guān)計劃、863計劃的經(jīng)驗。2. 本項目參加單位均具有本研究所需的工作條件，包括較大面積的實驗室（參與HIV、HBV及細菌研究的單位分別具有相應(yīng)的P3及P2實驗室）、相應(yīng)的實驗平臺和大型儀器設(shè)備。3. 具有完備的科研梯隊，包括學(xué)術(shù)帶頭人、學(xué)術(shù)骨干、中青年學(xué)術(shù)帶頭人及實驗技術(shù)人員，年齡結(jié)構(gòu)上具有以中青年為主的老、中、青梯隊。四、年度計劃年度研究內(nèi)容預(yù)期目標第一年1. 耐藥病原體的分子流行病學(xué)研究：建立耐藥病原體菌種庫，分析主要耐藥基因型，基因分布，研究并建立耐藥檢測新技術(shù)。2. 耐藥基因的生物學(xué)特點，與藥物間相互關(guān)系研究：分析耐藥基因不同位置突變與耐藥之間的關(guān)系。3. 藥物與靶位相互作用研究：研究HIV-1 RT/DNA在與核苷酸類似物（如AZT、3TC、PMEA等）結(jié)合狀態(tài)下