大豆皂苷的分離純化

1、題目： 葡聚糖凝膠色譜葡聚糖凝膠色譜結(jié)合結(jié)合制備型高效液相色譜制備型高效液相色譜分離純化大豆皂苷分離純化大豆皂苷 大豆皂苷大豆皂苷 皂苷皂苷又名皂甙或皂素，是固醇類或三萜類化合物的又名皂甙或皂素，是固醇類或三萜類化合物的低聚配糖體低聚配糖體總總稱，因其水溶液能形成持久泡沫，象肥皂一樣而得名，它廣泛存在于稱，因其水溶液能形成持久泡沫，象肥皂一樣而得名，它廣泛存在于植物和海洋動(dòng)物體內(nèi)植物和海洋動(dòng)物體內(nèi)。大豆皂苷大豆皂苷是一種常見的皂苷，它主要存在于是一種常見的皂苷，它主要存在于豆科植物豆科植物中。豆類植中。豆類植物種子中大豆皂苷的含量一般在物種子中大豆皂苷的含量一般在0.62%-6.16%之間。之

2、間。大豆皂苷是皂苷研究中起步較晚的一類大豆皂苷是皂苷研究中起步較晚的一類, 大豆皂苷具有明顯的大豆皂苷具有明顯的溶血溶血作用作用, 對(duì)人體健康不利對(duì)人體健康不利, 被視為被視為抗?fàn)I養(yǎng)因子抗?fàn)I養(yǎng)因子, 同時(shí)它具有苦味同時(shí)它具有苦味, 導(dǎo)致大豆導(dǎo)致大豆制品具有苦澀味制品具有苦澀味, 因此在豆類食品加工中總被設(shè)法除去。近年來，國內(nèi)因此在豆類食品加工中總被設(shè)法除去。近年來，國內(nèi)外大量研究表明：大豆皂苷外大量研究表明：大豆皂苷不僅毒副作用很小不僅毒副作用很小，而且其本上還具有許，而且其本上還具有許多多對(duì)人體健康有益對(duì)人體健康有益的生理功能。的生理功能。大豆皂苷的化學(xué)組成大豆皂苷的化學(xué)組成 大豆皂苷大豆皂

3、苷( Soyasapon ins)屬于屬于三萜類齊墩果酸型三萜類齊墩果酸型皂苷皂苷, 是三萜類同是三萜類同系物的系物的羥基羥基和糖分子環(huán)狀和糖分子環(huán)狀半縮醛羥基半縮醛羥基失水縮合而成失水縮合而成, 它可以水解生成多它可以水解生成多種種糖類糖類和和配糖體配糖體, 目前已確認(rèn)的大豆皂苷約目前已確認(rèn)的大豆皂苷約18種種, 是由是由5種皂苷元種皂苷元( Soyasapogeno 、)和糖基中的和糖基中的D 一葡萄糖醛酸一葡萄糖醛酸(glcUA)、D一葡萄糖一葡萄糖(glc)、D一半乳糖一半乳糖(ga1)、 D一木糖一木糖(xy1)、一一L一阿拉伯糖一阿拉伯糖(am) 、一一L一鼠李糖一鼠李糖(rha)

4、，6種單糖以及乙?；蠓N單糖以及乙酰基大豆皂苷豆皂苷(A cety1- soyasaponin ) 所組成。所組成。 大豆皂苷依據(jù)其皂苷元的結(jié)構(gòu)可分為大豆皂苷依據(jù)其皂苷元的結(jié)構(gòu)可分為A族、族、B族、族、E族、族、DDMP族族大豆皂苷。大豆皂苷。大豆皂苷的理化性質(zhì)大豆皂苷的理化性質(zhì) 物理性質(zhì)物理性質(zhì) 純大豆皂苷為白色粉末, 具有辛辣味和微苦味, 對(duì)人體各部位的粘膜具有強(qiáng)烈的刺激性。大豆皂苷是兩親性化合物, 具有親水和親油兩種性質(zhì)。大豆皂苷還可溶于水, 易溶于熱水、稀醇、熱甲醇和熱乙醇中, 而且在含水丁醇或戊醇中的溶解度較好, 但它不溶或難溶于乙醚、苯等極性小的有機(jī)溶劑。大豆皂苷具有熱穩(wěn)定性, 熔

5、點(diǎn)很高, 一般在熔融前就分解, 無明顯的熔點(diǎn)。 化學(xué)性質(zhì)化學(xué)性質(zhì) 大豆皂苷顯大豆皂苷顯酸性酸性, , 加入甲酸能改善分離度。大豆皂苷溶液加入硫酸加入甲酸能改善分離度。大豆皂苷溶液加入硫酸銨、醋酸鉛等中性鹽類可產(chǎn)生沉淀。銨、醋酸鉛等中性鹽類可產(chǎn)生沉淀。大豆皂苷與苯肼反應(yīng)生成紅棕色沉淀, 與五氯化銻反應(yīng)顯紫藍(lán)色, 在冰醋酸- 乙酰氯溶液中呈紅色, 于氯仿- 硫酸中呈現(xiàn)綠色熒光 。故可應(yīng)用這些性質(zhì), 來檢測食物中的大豆皂苷的含量。應(yīng)用前景應(yīng)用前景 大豆皂苷是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的天然生理活性物質(zhì), 具有抗癌抗癌、調(diào)節(jié)免疫功能調(diào)節(jié)免疫功能、防治心血管疾病防治心血管疾病、抗菌抗菌、抗抗病毒病毒、護(hù)肝護(hù)肝

6、等多重生理功效。除用作藥物外, 皂苷還可以作為高級(jí)化妝品高級(jí)化妝品和食品添加劑食品添加劑,如作為殺菌劑、抗氧化劑、發(fā)泡劑等在化妝品和食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用, 以及作為表表面活性劑面活性劑應(yīng)用于化學(xué)化工行業(yè)。 我國是大豆生產(chǎn)大國, 資源非常豐富。每年用于加工豆制品和榨油所消耗的大豆數(shù)量非常巨大, 但目前對(duì)大豆的利用僅限于提取油脂和蛋白質(zhì)僅限于提取油脂和蛋白質(zhì), 存在于葉子和副產(chǎn)品中的大豆皂苷常常被大量丟棄, 十分可惜。若能充分利用大豆廢料大豆廢料中像皂苷這樣的特殊成分, 必將獲得較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。大豆皂苷的分離純化大豆皂苷的分離純化 大豆中除了含有大量的脂質(zhì)和糖質(zhì), 還含有固

7、醇配糖體、異黃酮糖體, 其中大豆皂苷的含量只有0.6 %,而且大豆皂苷是強(qiáng)極性酸性皂苷強(qiáng)極性酸性皂苷, 有復(fù)雜的化學(xué)成分, 所以大豆皂苷的分離提取比較困難。 大豆皂苷和異黃酮在大豆中共存，在用乙醇浸提和大孔吸附樹脂提取大豆皂苷時(shí)， 往往會(huì)與大豆異黃酮大豆異黃酮一并被提取出來，它們分子極性有重疊，結(jié)構(gòu)類似分子極性有重疊，結(jié)構(gòu)類似，皆是由苷元與配糖體組成的糖苷類組分， 這對(duì)大豆皂苷單體的制備造成了很大的干擾，因此需要除去大豆異黃酮，利用高純度總大豆皂苷來制備單體。 葡聚糖凝膠色譜法葡聚糖凝膠色譜法分離大豆皂苷和大豆異黃酮分離大豆皂苷和大豆異黃酮 大豆皂苷與大豆異黃酮存在結(jié)構(gòu)與分子質(zhì)量的差異，大豆皂

8、苷為三萜類糖苷，大豆異黃酮中有一定量的異黃酮糖苷， 大豆皂苷分子質(zhì)量在7661 436，大豆異黃酮分子質(zhì)量在254532。 兩種總體化合物分子立體結(jié)構(gòu)之間存在較大的差異，因此可以采用葡聚糖凝膠色譜分離技術(shù)對(duì)兩種總體化合物進(jìn)行初步的分離。 大豆皂苷的分離純化大豆皂苷的分離純化 葡聚糖凝膠色譜也稱為分子排阻色譜， 凝膠柱系由均勻裝填的多孔凝膠微粒組成， 小分子可以進(jìn)入孔隙之中，大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，只能隨流動(dòng)相在凝膠顆粒間隙中流動(dòng)，最先被淋洗出來，因此作為分子篩使用，分離大小不同的分子。 這一技術(shù)為蛋白質(zhì)等生物大分子提供了非常溫和的分離方法。本試驗(yàn)中采用甲醇為洗脫溶劑，利用葡聚糖凝膠色譜法分離得到高

9、純度的總大豆皂苷，為后續(xù)大豆皂苷單體制備提供很好的原料。分離純化方法分離純化方法 制備型高效液相色譜技術(shù)制備型高效液相色譜技術(shù)以獲得大量的單成分為目的，具有分離條件比較溫和，分離檢測過程中一般沒有樣品被破壞，裝置簡單有效等優(yōu)點(diǎn)，在天然藥物的研究中發(fā)揮了重要作用。被稱為對(duì)維生素補(bǔ)充劑的“定案”。文章作者，來自美國約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院以及英國華威大學(xué)，還有一位是該雜志的高級(jí)副主編，“均為醫(yī)學(xué)界翹楚”。1 葡聚糖凝膠色譜法分離大豆皂苷和異黃酮葡聚糖凝膠色譜法分離大豆皂苷和異黃酮 利用葡聚糖凝膠色譜法分離大豆皂苷和大豆異黃酮，濕法填裝葡聚糖凝膠色譜柱（49mm310mm）。稱取400mg 大豆皂苷粗提物

10、，溶解于1mL 甲醇。進(jìn)樣體積150 L，采用甲醇為洗脫劑，設(shè)定洗脫流速3mL/min，選定監(jiān)測波長為215nm，根據(jù)制備圖譜接收了5 個(gè)組分峰。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收甲醇，冷凍干燥得粉末樣品。 分離純化方法分離純化方法 圖1 為采用1.2.2 節(jié)方法分離大豆皂苷和大豆異黃酮215nm 處紫外吸收譜圖。由葡聚糖凝膠色譜法的原理、各類皂苷和異黃酮的紫外吸收特征以及分子結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量的差異， 結(jié)合HPLC 圖1 為分離大豆皂苷和大豆異黃酮215nm 處紫外吸收譜圖。由葡聚糖凝膠色譜法的原理、各類皂苷和異黃酮的紫外吸收特征以及分子結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量的差異， 結(jié)合HPLC分析， 初步推斷峰1 為A 類大豆皂苷，

11、峰2 為DDMP 類及B 類大豆皂苷，峰3、峰4 和峰5 為異黃酮峰。2 高效液相色譜法制備大豆皂苷單體高效液相色譜法制備大豆皂苷單體 制備型高效液相色譜技術(shù)制備型高效液相色譜技術(shù)以獲得大量的單成分為目的，具有分離條件比較溫和，分離檢測過程中一般沒有樣品被破壞，裝置簡單有效等優(yōu)點(diǎn)，在天然藥物的研究中發(fā)揮了重要作用。 利用制備型高效液相色譜儀，通過優(yōu)化流動(dòng)相、梯度洗脫程序、進(jìn)樣量，以總大豆皂苷為原料，進(jìn)行大豆皂苷單體制備。根據(jù)譜圖手動(dòng)收集各個(gè)峰組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙腈，冷凍干燥得粉末狀樣品，進(jìn)行HPLC 純度檢測及UPLC-MS 分析。被稱為對(duì)維生素補(bǔ)充劑的“定案”。文章作者，來自美國約翰霍普金

12、斯醫(yī)學(xué)院以及英國華威大學(xué)，還有一位是該雜志的高級(jí)副主編，“均為醫(yī)學(xué)界翹楚”。利用高效液相色譜法對(duì)各個(gè)峰組分進(jìn)行分析利用高效液相色譜法對(duì)各個(gè)峰組分進(jìn)行分析 檢測條件如下： 分離柱：Aquasil C18 （150mm4.6mm，3m）；溫度：30 ；樣品濃度：5mg 皂苷樣品溶于1mL 甲醇；進(jìn)樣體積：20L；流動(dòng)相流速：1mL/min；流動(dòng)相：A：0.002%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸-水溶液，B：0.002%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸-乙腈溶液；檢測器：二極管陣列檢測器（200800nm，205nm 為監(jiān)控波長），蒸發(fā)光散射檢測器； HPLC 梯度洗脫程序?yàn)椋?010min，10% B；1030min，1030

13、% B； 3080min，3040% B；80 90min，40100% B； 90 110min，100%B；110120min，10010%B。 各種分離純化方法的比較各種分離純化方法的比較 對(duì)身體而言，永不相負(fù)的萬靈藥并不是補(bǔ)劑，而是均衡膳食與規(guī)律運(yùn)動(dòng)。對(duì)身體而言，永不相負(fù)的萬靈藥并不是補(bǔ)劑，而是均衡膳食與規(guī)律運(yùn)動(dòng)。 HPLC 分析按照?qǐng)D1 接收的5 個(gè)峰組分，并與大豆皂苷粗提物的HPLC 分析譜圖進(jìn)行對(duì)比， 結(jié)果如圖2 所示。由HPLC 保留時(shí)間可以確定峰1 和峰2 是皂苷；峰3、峰4 和峰5 是異黃酮，不含任何種類的皂苷，由此看出，凝膠色譜可以很好地將大豆異黃酮和大豆皂苷分離， 能得

14、到較高純度的大豆皂苷粗分產(chǎn)物， 這將有利于大豆皂苷單體的制備。3 大豆皂苷單體純度分析和結(jié)構(gòu)鑒定大豆皂苷單體純度分析和結(jié)構(gòu)鑒定 采用最優(yōu)HPLC 制備條件進(jìn)行大豆皂苷單體的分離純化，得到如圖3 所示的譜圖： 對(duì)身體而言，永不相負(fù)的萬靈藥并不是補(bǔ)劑，而是均衡膳食與規(guī)律運(yùn)動(dòng)。對(duì)身體而言，永不相負(fù)的萬靈藥并不是補(bǔ)劑，而是均衡膳食與規(guī)律運(yùn)動(dòng)。 3 大豆皂苷單體純度分析大豆皂苷單體純度分析 HPLC 分析大豆皂苷單體純度分析大豆皂苷單體純度 從第33min 開始，按照保留時(shí)間手動(dòng)接收峰組分，至76min 共接收到17 個(gè)峰組分。參考保留時(shí)間以及紫外最大吸收波長推出，33min 之前為大豆異黃酮特征峰，

15、通過比較異黃酮和皂苷的峰面積， 再次說明利用葡聚糖凝膠色譜能分離出絕大部分異黃酮， 這樣對(duì)皂苷單體制備的干擾就減少了很多。同時(shí)，峰14、15、16 和17在295nm 有最大紫外吸收，從而可以推斷此4 個(gè)峰組分為DDMP 類皂苷。此外，制備譜圖所示，經(jīng)優(yōu)化后所采用的制備條件，各個(gè)峰分離度較好，達(dá)到了基線分離的效果。 對(duì)身體而言，永不相負(fù)的萬靈藥并不是補(bǔ)劑，而是均衡膳食與規(guī)律運(yùn)動(dòng)。對(duì)身體而言，永不相負(fù)的萬靈藥并不是補(bǔ)劑，而是均衡膳食與規(guī)律運(yùn)動(dòng)。 HPLC 檢測皂苷單體純度檢測皂苷單體純度 HPLC 分析結(jié)果表明，制備得到9 種純度90%以上的大豆皂苷，其中99%以上的大豆皂苷單體4 種。有些成分

16、因含量極少， 由于滯后性或者后續(xù)處理， 其純度不高。盡管所有的提取及處理溫度都在40 以下，但是因DDMP 類皂苷的穩(wěn)定性差， 仍然有部分DDMP 類皂苷降解為B 類皂苷。4 UPLC-MS 鑒定大豆皂苷單體鑒定大豆皂苷單體 利用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用檢測確定高效液相色譜制備得到的各個(gè)峰組分。 UPLC 條件：條件： 分離柱Acquity C18 BEH（250mm10.0mm，0.17um）； 流動(dòng)相為A：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-水，B：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-乙腈，流速0.3mL/min； 梯度洗脫程序 03min，1040%B；38min，4070%B； 812min

17、，70100% B；1220min，100%B； 2020.5min，10010%B；20.522min，100%B。 質(zhì)譜條件：質(zhì)譜條件： 毛細(xì)管電壓3.2 kV， 取樣錐電壓35V，二級(jí)錐孔電壓5V，離子源溫度110，脫溶溫度350 ，脫溶劑氣流量600.0 L/Hr，質(zhì)核比掃描范圍1001 500。對(duì)身體而言，永不相負(fù)的萬靈藥并不是補(bǔ)劑，而是均衡膳食與規(guī)律運(yùn)動(dòng)。對(duì)身體而言，永不相負(fù)的萬靈藥并不是補(bǔ)劑，而是均衡膳食與規(guī)律運(yùn)動(dòng)。 根據(jù)制備出的單體的質(zhì)量，選擇了1、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、17 號(hào)峰進(jìn)行了UPLC-MS 結(jié)構(gòu)鑒定。由于在制備時(shí)通過紫外吸收特征得出峰2

18、 和峰7 為異黃酮峰；峰3 和峰5 出現(xiàn)的穩(wěn)定性差；而峰16 最終收集得到的質(zhì)量很少，故而以上各峰未進(jìn)行檢測。 根據(jù)制備出的單體的質(zhì)量，選擇了1、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、17 號(hào)峰進(jìn)行了UPLC-MS 結(jié)構(gòu)鑒定。由于在制備時(shí)通過紫外吸收特征得出峰2 和峰7 為異黃酮峰；峰3 和峰5 出現(xiàn)的穩(wěn)定性差；而峰16 最終收集得到的質(zhì)量很少，故而以上各峰未進(jìn)行檢測。 如圖4 所示， 其中395.6649 是大豆皂苷ac3-Ab（1394）分子結(jié)合一個(gè)氫原子形成的，975.5149是ac3-Ab 分子失去C-22 位末端的Ara （133）和Glc（162）及其上的3 個(gè)乙?；俳Y(jié)合一個(gè)氫原子形成的， 可以推斷1 號(hào)峰為大豆皂苷ac3-Ab。同理分析其余各峰的質(zhì)譜圖，確定峰4、峰6、峰8及峰13 分別為大豆皂苷Aa、Ab、Ae、Be。9 號(hào)峰和10 號(hào)峰、11 和12 號(hào)峰質(zhì)譜圖基本相同，分析后判斷分別為大豆皂苷Af 和大豆皂苷Bb。參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn) 1 KITAGAWA I. Revised structures of soyasapogenols A, B and E,oleanene- sap