焦磷酸測序技術(shù)的原理

1、Pyrosequencing技術(shù)的原理Pyrosequencing是一項(xiàng)全新的DNA測序技術(shù)，可以快速、準(zhǔn)確地測定一段較短的目標(biāo)片段。其基本原理 如下：第1步：1個(gè)特異性的測序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物（包括 DNA Polymerase ATPSulfurylase、Luciferase 和 Apyrase）和底物混合物（包括 APS和 Luciferin ）。第2步：向反應(yīng)體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對，則會(huì)在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸（PP）。Polvn-|&ra>5«

2、苗島人+馭IP> (ONA)n+14-PPi第2步圖示（圖片來自互聯(lián)網(wǎng)）第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的 PPi可以和APS結(jié)合形成ATP在熒光素酶的催化下，生成的 ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。lightSulfurvlasf+ PPi A1T»hidfiarin vxviucvfvrincATP LightLuciferaseseen as 鼻p亡ii*dis pyrrain第3步圖示（圖片來自互聯(lián)網(wǎng)）第4步：反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量 ATP在Apy

3、rase的作用下發(fā)生降解d ntf p + -ahMF + 眄“旳辭ATP ftOP t phosphate第4步圖示（圖片來自互聯(lián)網(wǎng)）第5步：加入另一種dNTP,使第2-4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。nucleotide sequencenucleotide edded第4步圖示（圖片來自互聯(lián)網(wǎng)）Pyrosequecing技術(shù)操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于SNP位點(diǎn)檢測、等位基因頻率測定、細(xì)菌和病毒分型等領(lǐng)域。-如果您認(rèn)為本詞條還有待完善，請編輯詞條上一篇SNP （單核苷酸多態(tài)性） 下一篇閱讀質(zhì)粒圖譜具體事例【摘要】建立了一種將序列標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（

4、PCR與焦磷酸測序技術(shù)結(jié)合的相對基因表達(dá)量測定法（簡稱“SRP”）先用來源特異性引物對不同來源的同一基因通過反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 上特異性標(biāo)簽，PCR后用焦磷酸測序法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列解碼，使得測序結(jié)果中的序列代表基因的來源，峰高代表基因在不同來源中的相對表達(dá)量。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對本方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，SRPP可以同時(shí)準(zhǔn)確測定同一基因在3個(gè)不同來源中的表達(dá)量，并實(shí)際測定了 Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表達(dá)量差異?！娟P(guān)鍵詞】序列標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄，聚合物鏈反應(yīng)，焦磷酸測序，基因表達(dá)1引言差異表達(dá)基因與疾病密切相關(guān)，深入研究可在基因水平揭示疾病的發(fā)病機(jī)制。目前，用于檢測基因表達(dá)水平

5、的技術(shù)主要有SAGE法1 、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法 2,3和基因芯片法4等。但這些方法存在儀器設(shè)備昂貴、定量性能差以及同時(shí)測定基因表達(dá)量的來源數(shù)目受限等缺點(diǎn)。焦磷酸測序技術(shù)是新近發(fā)展起來的一種基于酶催化化學(xué)反應(yīng)的測序技術(shù)58，不需要使用熒光標(biāo)記，定量性能好。目前，焦磷酸測序技術(shù)多用于單核苷酸多態(tài)性（SNP分析、微生物分型和基因甲基化分析等。本研究將焦磷酸測序技術(shù)用于基因表達(dá)量差異的比較分析， 考察了其可行性和準(zhǔn)確性，并將其應(yīng)用于檢測Egr1基因在糖尿病、肥胖癥和正常小鼠中的差異表達(dá)。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器、試劑與材料21R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司）;Gene Spe川微量核酸

6、蛋白測定儀（日本Naka Instrument 公司）;PTC 225 PCR擴(kuò)增儀、Opticon 實(shí)時(shí)熒光 PCR儀（美國 MJ Research公 司）。焦磷酸測序裝置由本實(shí)驗(yàn)室自行組裝9,10。此裝置主要由焦磷酸測序反應(yīng)模塊、熒光信號(hào)放大和數(shù)據(jù)采集 3部分組成。反應(yīng)模塊由位于中間的反應(yīng)池通過毛細(xì)管與四周的dNTP儲(chǔ)液池相連組成。通過注射器施壓使4種dNTP循環(huán)加入反應(yīng)池完成測序反應(yīng)。熒光信號(hào)通過R6335光電倍增管（日本Hamamatsu Photonics K.K.公司）放大后，經(jīng)BPCL微弱發(fā)光測量儀（北 京中國科學(xué)院生物物理研究所）采集數(shù)據(jù)。Hotstar Taq DNA聚合酶、

7、Omniscript RT kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國Qiagen公司);Trizol(上海 Inviotrogen公司);熒光素、熒光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶和5'磷酸化硫酸腺苷(美國Sigma公司);Dynabeads M 280鏈霉親和素磁珠(挪威Dynal AS公司); Klenow DNA聚合酶(美國Promega公司);所有引物均由上海 Invitrogen公司合成。實(shí)驗(yàn)中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝組織由南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。2.2 RNA的提取用Trizol試劑盒抽提RNA,用紫外分光光度法測定RNA濃度及純度。2.3反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一

8、鏈取等量的不同來源的總RNA,分別以來源特異性反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。即取總RNA 0.052.0卩至Nuclease free的小管中，力口 DEPC H2O至12卩L;65C反應(yīng)5 min后，置冰上至 少1 min;在上述各小管中加入10X第一鏈合成緩沖液 2 Z 0.5 mmol/L dNTP混合物，10 URNase 抑制劑，200 U Omniscript Reverse Transcriptase , 1 卩 mol/l反轉(zhuǎn)錄引物，力口 DEPC H2O 至總體積為20 。反轉(zhuǎn)錄條件為：37 °C反應(yīng)1 h, 93 C反應(yīng)5 min，然后中止反應(yīng)。2.4基因特異性PCR不同來源

9、的 cDNA等比例混合，以共用引物CP(5' CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC'和生物素標(biāo)記的基因特異性引物(GSP進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR體系為：cDNA等比例混合液1 uL0.3 卩 mol/L (和 GSP 1.5 mmol/L Mg2+ ,0.2 mmol/L dNTP 混合物，10 x PCRg沖液 5 u,L5 x Q溶液10卩L 1 U HotStar Taq DNA聚合酶，并加入滅菌蒸餾水至 50卩。PCR反應(yīng)程序 為：94 C 變性 15 min，熱循環(huán) 35 次(94 C , 40 s; 60 C , 40 s; 72 C , 1 min )

10、,72 C延伸10 min , 4 C保存。基因特異性引物的序列見表1。表1實(shí)驗(yàn)用引物2.5焦磷酸測序固相單鏈模板的制備取5 戴諾磁珠(Dynabeads),用磁鐵吸棄上清液。 磁珠以100卩L B&W Buffer(10 mmol/L Tris HCl, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA, 2.0 mol/L NaCl)洗滌兩遍，最終懸浮于 50 卩 L B&WS沖液中； 加入50卩L PC產(chǎn)物，37 C反應(yīng)30 min;用磁鐵吸棄上清液，磁珠以 180卩L H2Ofc滌兩遍， 加入0.1 mol/L NaOH溶液20 uL混勻室溫放置 5 min使PCR產(chǎn)物變性；

11、磁鐵吸棄上清液，磁 珠以100 u L B&W緩沖液洗滌兩遍，100 u L 1退火緩沖液洗一遍， 最終溶于8 u L 1退火緩沖 液中加入1 u L 10 u mo測序引物，93 C混勻30 s, 55 C退火3 min, 4 C保存，待測序 用。2.6焦磷酸測序反應(yīng)焦磷酸測序標(biāo)準(zhǔn)混合液的組成為：0.1 mol/L Tris Ac緩沖液(pH 7.7), 2 mmol/L EDTA,10 mmol/L Mg(Ac)2 , 0.1% BSA 1 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT), 3 u mol/L 5 磷酸化硫酸腺苷 (adenosine 5' phosphosulfate

12、 , APS, 0.4 u g/L PVR5.4 mmol/L D 蟲熒光素，2 x 10-4 U/L 三磷酸腺苷硫酸化酶，2x 10-3 U/L三磷酸腺苷雙磷酸酶，18x 10-3 U/L無外切酶活性的 Kle now DNA聚合酶，14.6 mg/L熒光素酶。3結(jié)果與討論3.1方法原理焦測序技術(shù)是一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)定量測定引物延伸副產(chǎn)物焦磷酸鹽(PPi)的測序技術(shù)。其原理是：引物與模板DNA退火后,在DNA聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase)的協(xié)同作用下完成 循環(huán)測序反

13、應(yīng)。當(dāng)加入的dNTP與模板互補(bǔ)時(shí)，DNA模板與互補(bǔ)的dNTP聚合可以產(chǎn)生等摩爾PPi;在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi與5'磷酸化硫酸腺苷(APS反應(yīng)生成等量的 ATP;在熒光素酶催化作用下，ATP與蟲熒光素(luciferin)反應(yīng)發(fā)出熒光。產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與聚 合的測序模板量和堿基數(shù)成正比，根據(jù)加入的dNTP類型和測得的熒光信號(hào)強(qiáng)度就可實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列。反應(yīng)方程式如下：(DNA) n+dNTPpolymerase(DNA) n+l+PPi(1)PPi+APSATP sulfurylaseATP+SO2-4(2)ATP+Luciferi n+O2luciferas

14、eAMP+PPi+Oxyluciferi n+CO2+hv(3)dNTPApyrasedNDP+PiApyrasedNMP+Pi(4)ATPApyraseADP+PiApyraseAMP+Pi(5)為了定量測定基因表達(dá)量差異，本研究將堿基序列標(biāo)記法與焦磷酸測序解碼技術(shù)相結(jié) 合，其關(guān)鍵點(diǎn)在于：在不同來源的同一基因中標(biāo)記上區(qū)別樣品來源的特異性標(biāo)簽；對標(biāo)記序列進(jìn)行解碼和定量測定。采用反轉(zhuǎn)錄引物將來源特異性堿基標(biāo)記到各來源待測基因，然后用焦磷酸測序定量測定標(biāo)記序列。具體測定過程如圖1所示：(1)用來源特異性反轉(zhuǎn)錄引物對不同來源的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物由4部分組成：5'端為共用序列；位于引物中間

15、的4個(gè)堿基為人為設(shè)計(jì)的來源特異性標(biāo)簽， 在圖1中以深淺不同的4個(gè)小圓點(diǎn)表示；3端為oligo(dT)n和用于固定oligo(dT)n位置的兩個(gè) 兼并堿基。來源特異性反轉(zhuǎn)錄引物的堿基組成和數(shù)目都相同，只是位于中間的來源特異性堿基的排列位置有所差異;(2)不同來源的cDNA稀釋后等比例混合;(3)用生物素標(biāo)記的基因特 異性引物和共用引物擴(kuò)增上述混合物，通過改變基因特異性引物就可以進(jìn)行任何基因的表達(dá)量差異分析;(4)用磁性微球技術(shù)將 PCR產(chǎn)物制備成單鏈，根據(jù)來源特異性反轉(zhuǎn)錄引物中來源 標(biāo)簽序列進(jìn)行焦磷酸測序。測序結(jié)果中，各來源特異性堿基的相對峰高即代表相對基因表達(dá) 量差異。本方法稱之為SRPP法

16、(Seque nee tagged reverse tran scription PCR withpyrosequencing)。圖1堿基序列標(biāo)記法結(jié)合焦磷酸測序解碼技術(shù)測定基因表達(dá)量差異的原理圖Fig.1 Prin ciple of comparative gene expressi on an alysis by coupli ng seque neetaggedreverse transcription polymerase chain reaction(PCR) with pyrosequencing (SRPP) 由于不同來 源的同一基因在單管中只用一對引物進(jìn)行 PCR并且擴(kuò)增產(chǎn)物的

17、堿基組成和含量完全一樣，僅4個(gè)堿基的排列順序不一樣，具有相同的保留時(shí)間。所以來源不同，表達(dá)量不同的同一基因在單管中能實(shí)現(xiàn)等比例擴(kuò)增。SRPP測定峰高比值也即能代表起始基因的相對表達(dá)量。3.2焦磷酸測序的定量特性在同一焦磷酸測序反應(yīng)體系中，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與ATP的量成正比，而 ATP的量與聚合的dNTP個(gè)數(shù)成正比，所以可以根據(jù)圖譜中測得的信號(hào)強(qiáng)度推測出模板DNA相對含量。為了驗(yàn)證焦磷酸測序的定量特性，人為設(shè)計(jì)了一條測序單鏈(5 ' GG TT CC AA G T C ACCCCGCCCGC3')和一條測序引物(5 ' GCGGGCGGGG 3'，使測序單鏈的

18、3端與測序引物單 鏈的5'端完全互補(bǔ)。兩條單鏈退火后按dTTidGTidATRzdCTP的順序循環(huán)遞加 dNTP進(jìn)行測序反應(yīng)。結(jié)果顯示，待測模板上測序引物的延伸序列為“ T G A C TT GG AA CCS堿基，其信號(hào)強(qiáng)度跟同質(zhì)區(qū)的相同堿基個(gè)數(shù)成正比。這一結(jié)果表明，峰強(qiáng)度與被引物延伸模板的量成正比，可通過測定各峰的峰高之比確定對應(yīng)的模板的相對含量。本研究利用焦磷酸測序技術(shù)的定量特性，通過測序圖譜中的峰高比值分析不同來源的基因相對表達(dá)量。3.3來源特異性基因的標(biāo)記及標(biāo)記模板的等比例擴(kuò)增SRPP法定量的關(guān)鍵在于能否在單管中等比例擴(kuò)增經(jīng)標(biāo)記的不同來源的同一基因。為了 驗(yàn)證SRPP法是否具

19、有此特性，人工模擬了一系列Actb基因的3個(gè)不同來源(分別命名為 來源G',來源T”和 來源C'進(jìn)行測定。具體方法為取同一來源的RNA樣品分成3等份，分別用來源特異性反轉(zhuǎn)錄引物RT G(5' CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC gate ttt ttt ttt ttt tttVN 3' ), RTT(5 ' CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC tacg ttt ttt ttt ttt ttt VN 3'和 RT C (5 'CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC catg ttt ttt

20、ttt ttt ttt VN 3'進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別被標(biāo) 記上 來源G'、來源T”和 來源C'的特異性標(biāo)簽(上述序列中的帶下劃線的斜體部分)。然后將上述經(jīng)標(biāo)記的 cDNA模板，分別以1 ： 1 ： 1, 5 : 1 : 1, 1 : 5 : 1和1 : 1 : 5(來源G :來源T : 來源C)的體積比混合，作為系列人工模擬模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測定結(jié)果如圖 2所示，序列中的第一個(gè)堿基“G代表 來源G'的模板；第二個(gè)堿基“T”表 來源T”的模板;第三個(gè)堿基“C”表 來源C'的模板。3個(gè)堿基信號(hào)峰的相對強(qiáng)度代表著Actb基因在3個(gè)不同來源中

21、的相對表達(dá)量。通過計(jì)算峰高的比值即可得到所測基因在不同來源中的表達(dá)差異。由于dNTP不穩(wěn)定，存在少量的分解產(chǎn)物PPi，在焦磷酸測序中可能會(huì)出現(xiàn)背景峰，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此，焦磷酸測序中每種dNTP都連續(xù)加入兩次，所以圖2中每次焦磷酸測序都出現(xiàn)6個(gè)峰。其中第1次得到的峰為信號(hào)峰，第2次為dNTP背景峰，計(jì)算結(jié)果時(shí)要在信號(hào)強(qiáng)度中扣除背景。3種來源模板等量混合(1 : 1 : 1)的測序結(jié)果如圖2A所示，測得的峰高比為1.1 : 1.0 : 1.0 (來源G :來源來源C),此測定值與模板理論比例1 : 1 : 1十分相近;如圖2(BD)所示，圖2 Actb基因在不同人工模擬 3種來源中的表達(dá)量差

22、異測序圖譜， 3種來源的理論表達(dá)量比為1 : 1 : 1(A), 5 : 1 : 1(B), 1 : 5 : 1(C)和 1 : 1 : 5(D)(每種dNTP都連續(xù)加入兩次以扣除其背景吸收)Fig.2 Pyrograms of simulated templates prepared by pooli ng three source specific cDNAs at the ratios of 1 : 1 : 1 (A), 5 : 1 : 1 (B), 1 : 5 : 1 (C), and 1 ： 1 ： 5 (D), respectively. PCR was performed by

23、using the com mon primer and the Actb gene specific primer. Eachdeoxyrib onu cleoside triphosphate(dNTP) was dispe nsed twice for detect ing the backgro und due to pyrophosphoric acid(PPi) impurity in dNTP solution 模板比例為 5 : 1 : 1, 1 : 5 : 1 和 1 : 1 : 5的SRPP測定結(jié)果分別為：5.1 : 1.0 : 1, 0.97 : 4.8 : 1和0.2

24、: 0.2 ： 1。結(jié)果表明，不同比 例的各標(biāo)記模板(各模板的差別僅是4個(gè)堿基的排列序列不同)得到了等比例擴(kuò)增，沒有序列 歧視性，即通過測定擴(kuò)增產(chǎn)物的比例就可以間接得到不同來源中基因的表達(dá)量差異。3.4準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，將本方法的測定結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行比較。采用本方法平行測定 2次，Actb基因在小鼠腎、心和腦中的相對表達(dá)量之比分別為38.8 :19.8 : 41.3和40.0 ： 19.5 : 40.5。平均值為 39.4 : 19.6 : 40.9。同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測得Actb基因在腎、心和腦中的相對表達(dá)量比值為37.8 : 22.0 : 40.2。與兩種方法測定結(jié)果一致，說明SRPP可以用于準(zhǔn)確測定同一基因在不同來源中的表達(dá)量差異。3.5 Egr1基因在糖尿