六味地黃丸微生物限檢查檢驗方法驗證方案版

1、 1.概述1.1六味地黃丸（濃縮丸）是中國藥典品種，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z42020681，其處方由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉組成，具有滋陰補腎之功效，用于腎陰虧損，頭暈耳鳴，腰膝酸軟，骨蒸潮熱，盜汗遺精，消渴。有效期：36個月。1.2根據(jù)劑型與產(chǎn)品處方判斷，六味地黃丸（濃縮丸）的微生物限度檢查內(nèi)容應(yīng)包括需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，以及大腸埃希菌、沙門菌、耐膽鹽革蘭陰性菌檢查；根據(jù)六味地黃丸（濃縮丸）的成分和歷史驗證數(shù)據(jù)分析，該產(chǎn)品無明顯的抑菌活性，擬采用“平皿法”進行微生物限度檢查，采用“常規(guī)法”進行控制菌檢查。2.目的確認(rèn)所采用的方法適用于該產(chǎn)品的微生物計數(shù)，以確保測定方法的

2、可靠性，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新進行適用性試驗。3. 依據(jù)中國藥典2015年版四部“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”、“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法”、“非無菌產(chǎn)品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)”。4.范圍本驗證方案適用于公司六味地黃丸微生物限度檢查檢驗方法的適用性試驗。5.職責(zé)5.1驗證領(lǐng)導(dǎo)小組5.1.1負責(zé)驗證方案的審批。5.1.2負責(zé)驗證的協(xié)調(diào)工作，以保證本驗證方案規(guī)定項目的順利實施。5.1.3負責(zé)驗證數(shù)據(jù)及結(jié)果的審核。5.1.4負責(zé)驗證報告的審批。5.1.5負責(zé)發(fā)放驗證證書。5.2質(zhì)量部5.2.1負責(zé)驗證所需的培養(yǎng)基、樣品、菌

3、液、緩沖液等的準(zhǔn)備。5.2.2負責(zé)取樣及對樣品的檢驗。5.3項目驗證小組5.3.1負責(zé)擬訂驗證方案。5.3.2負責(zé)驗證方案的實施和收集各項驗證試驗記錄，并對試驗結(jié)果進行分析后，起草驗證報告，報驗證領(lǐng)導(dǎo)小組。6.驗證實施條件6.1驗證方案培訓(xùn)：在驗證實施前，應(yīng)對參與驗證的人員進行驗證方案以及與驗證相關(guān)的文件進行培訓(xùn)，確保相關(guān)人員掌握了驗證的相關(guān)要求與知識。6.2微生物限度檢測室：檢驗所使用的檢測室應(yīng)經(jīng)過HVAC系統(tǒng)確認(rèn)，并符合要求。6.3檢驗用水：驗證過程使用的純化水其制備系統(tǒng)應(yīng)經(jīng)過確認(rèn)并符合要求，純化水質(zhì)量應(yīng)經(jīng)過檢驗并符合中國藥典2015年版二部的要求。6.4檢驗儀器設(shè)備：驗證涉及的檢驗儀器（

4、設(shè)備）與檢驗方法，應(yīng)經(jīng)過技術(shù)監(jiān)督局校驗合格或者公司確認(rèn)/驗證合格。6.5培養(yǎng)基：驗證所使用的培養(yǎng)基應(yīng)經(jīng)過培養(yǎng)基的適用性檢查，其結(jié)果符合中國藥典的相關(guān)要求。見附件2:培養(yǎng)基確認(rèn)。6.6驗證菌種：驗證所使用的菌種，其種類與傳代次數(shù)應(yīng)符合中國藥典的相關(guān)要求。菌種情況見附件3:菌種確認(rèn)。7.合格標(biāo)準(zhǔn)7.1在需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)的三次獨立平行試驗中，試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)。7.2在控制菌檢查的試驗中試驗組應(yīng)檢出試驗菌，陽性對照組應(yīng)檢出試驗菌，陰性對照組不得檢出試驗菌。8.驗證方法8.1菌液制備：8.1.1取銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃

5、希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物各1ml,分別加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋至10-5-10-7。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。8.1.2取1ml上述制備的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液分別注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。8.1.3、取1ml上述

6、制備白色念珠菌、黑曲霉菌液注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。結(jié)果：見附件4:菌液濃度確定。8.2需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法適用性試驗8.2.1供試液制備：稱取供試品10g,用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至100ml，用勻漿儀等適宜的方法混勻，制成1:10供試液。8.2.2試驗組：吸取1:10的供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液后搖勻。8.2.3菌液對照品：吸取稀釋液胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入與試驗組相同的菌懸液后搖勻。8.2.4試驗組和菌液對照組搖勻后，分別從所有試驗菌試管中吸取1ml注入直徑

7、90mm的平皿中，傾注胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基；另分別吸取白色念珠菌1ml注入直徑90mm的平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；平行2份。8.2.5供試品對照組：吸取1:10的供試液1ml注入直徑90mm的平皿中，平行四份，其中兩個平皿中注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另兩個注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，搖勻。8.2.6將以上平皿分別置3035或2025培養(yǎng)，需氧菌培養(yǎng)不超過3天，真菌培養(yǎng)不超過5天，在3天和5天分別進行計數(shù)。8.2.7計算公式：8.2.8試驗結(jié)果：見附件5:需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性檢查結(jié)果附件6:霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性檢查結(jié)果8.3控制菌檢查大腸埃希菌供試液制備：同“需氧菌、霉菌和酵

8、母菌計數(shù)方法適用性試驗”供試液制備。試驗組：取1：10供試液10ml和100cfu大腸埃希菌菌液加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824h；取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244培養(yǎng)2448h；取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872h。陽性對照：取100cfu大腸埃希菌菌液加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其他同試驗組。陰性對照：取100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，3035培養(yǎng)1824h；其他同試驗組。8.3.1.5結(jié)果：見附件6:大腸埃希菌方法適用性檢查結(jié)果沙門菌8.3.2.1供試液制備：同“需氧菌、霉菌和酵

9、母菌計數(shù)方法適用性試驗：供試液制備。8.3.2.2試驗組：8.3.2.2.1取供試液10ml和100cfu乙型副傷寒沙門菌菌液，加入200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824h。.2.2取上述培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824h。.2.3取少量RV沙門增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1848h。陽性對照：取100cfu乙型副傷寒沙門菌試驗菌液，加入200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。其他同試驗組。 8.3.2.4陰性對照：取200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30-35培養(yǎng)18-24h。其他同試驗組。

10、8.3.2.5結(jié)果：見附件7:沙門菌方法適用性檢查結(jié)果8.3.3.耐膽鹽革蘭陰性菌8.供試液制備：稱取供試品10g,用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至100ml，用勻漿儀等適宜的方法混勻，制成1:10、1:100、1:1000的供試液，2025培養(yǎng)2h。8.試驗組：取10ml/支腸道菌增菌液體培養(yǎng)基3支，分別加入上述預(yù)培養(yǎng)的1:10、1:100、1:1000的供試液各1ml，和100cfu大腸埃希菌菌液，混勻，3035培養(yǎng)2448h；取上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，3035培養(yǎng)1824h。8.陽性對照：取100cfu大腸埃希菌菌液加入10ml/支的腸道增菌液體培養(yǎng)基中，混勻，

11、3035培養(yǎng)2448h；其他同試驗組。8.陰性對照：取1支腸道增菌液體培養(yǎng)基10ml管，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1ml，混勻，3035培養(yǎng)2448h；其他同試驗組。8.結(jié)果：見表9:耐膽鹽革蘭陰性菌方法適用性檢查結(jié)果。8.結(jié)論：三個批次樣品，試驗組均：檢出，未檢出試驗菌；陽性對照組均：檢出，未檢出試驗菌；陰性對照組均：檢出，未檢出試驗菌，擬定該產(chǎn)品耐膽鹽革蘭陰性菌檢查采用 法進行檢查。8.3.3.7結(jié)果：見附件9:耐膽鹽革蘭陰性菌方法適用性檢查結(jié)果9.異常情況與偏差處理：當(dāng)出現(xiàn)偏差時，應(yīng)按偏差處理管理規(guī)程進行處理。10.驗證結(jié)果評定、結(jié)論與建議驗證小組組長負責(zé)收集各項驗證、試驗記錄，根據(jù)驗證、

12、試驗結(jié)果對驗證效果進行綜合評審，起草驗證報告、做出驗證結(jié)論。對驗證結(jié)果的評審應(yīng)包括一下內(nèi)容：10.1驗證試驗是否有遺漏？10.2驗證實施過程中對驗證方案有無修改？修改原因、依據(jù)以及是否經(jīng)過批準(zhǔn)？10.3驗證記錄是否完整？10.4驗證試驗結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求？偏差及對偏差的說明是否合理？是否需要進一步補充試驗？11.附件11.1 附件1:驗證實施條件確認(rèn) 11.2 附件2:培養(yǎng)基確認(rèn)11.3 附件3:菌種確認(rèn)11.4 附件4:菌液濃度確定11.5 附件5:需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性檢查結(jié)果11.6 附件6:霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性檢查結(jié)果11.7 附件7:大腸埃希菌菌方法適用性檢查結(jié)果11.

13、8 附件8:沙門菌方法適用性檢查結(jié)果11.9 附件9:耐膽鹽革蘭陰性菌方法適用性檢查結(jié)果11.10 附件10:驗證結(jié)果審批表附件1： 設(shè)施設(shè)備驗證確認(rèn)設(shè)施設(shè)備名稱驗證報告編號驗證結(jié)果實驗室HVAC系統(tǒng)純化水系統(tǒng)LDZX-40A型立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器PSH-500A型生化培養(yǎng)箱303AS-2型電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱SW-CJ-1C型雙人凈化工作臺確認(rèn)結(jié)論： 確認(rèn)人： 確認(rèn)日期：附件2： 培養(yǎng)基確認(rèn)培養(yǎng)基名稱來源批號適用性檢查結(jié)果胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基/胰酪大豆胨液體對照培養(yǎng)基/沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基/麥康凱液體培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培

14、養(yǎng)基麥康凱液體對照培養(yǎng)基/麥康凱瓊脂對照培養(yǎng)基/RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基/木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂對照培養(yǎng)基/三糖鐵瓊脂對照培養(yǎng)基/腸道菌增菌液體培養(yǎng)基紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基腸道菌增菌液體對照培養(yǎng)基/紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基/確認(rèn)結(jié)論： 確認(rèn)人： 確認(rèn)日期：附件3： 菌種確認(rèn)培養(yǎng)基名稱來源批號金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26 003銅綠假單胞菌CMCC(B ) 10 104枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63 501白色念珠菌CMCC(F ) 98 001大腸埃希菌CMCC(B) 44 102黑曲霉CMCC(B) 98

15、003確認(rèn)結(jié)論： 確認(rèn)人： 確認(rèn)日期：附件4：菌液濃度確定10-310-410-510-610-7銅綠假單胞菌皿1皿2金黃色葡萄球菌皿1皿2大腸埃希菌皿1皿2枯草芽孢桿菌皿1皿2白色念珠菌皿1皿2白色念珠菌（沙氏）皿1皿2黑曲霉皿1皿2黑曲霉（沙氏）皿1皿2結(jié)論： 根據(jù)要求，菌數(shù)要控制在每1ml中含菌數(shù)在100cfu，因此，我們確定菌液制備：銅綠假單胞菌： 稀釋 金黃色葡萄球菌: 稀釋 大腸埃希菌： 稀釋 枯草芽孢桿菌: 稀釋 白色念珠菌（胰酪）: 稀釋 白色念珠菌（沙氏）: 稀釋黑曲霉（胰酪）：稀釋 黑曲霉（沙氏）： 稀釋 檢驗人檢驗時間 年 月 日- 年 月 日復(fù)核人復(fù)核時間 年 月 日附

16、件5:需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性檢查結(jié)果樣品批號：菌種菌液對照組試驗組稀釋度：1:10比值（0.5-2）3天5天3天5天3天5天金黃色葡萄球菌/銅綠假單胞菌/枯草芽孢桿菌/白色念珠菌黑曲霉供試品對照組：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基：（ ）CFU/平皿1， （ ）CFU/平皿2陰性對照組：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基：（ ）CFU/平皿1， （ ）CFU/平皿2檢驗人檢驗時間 年 月 日- 年 月 日復(fù)核人復(fù)核時間 年 月 日附件6:霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性檢查結(jié)果樣品批號：菌種菌液對照組試驗組比值（0.5-2）3天5天3天5天3天5天白色念珠菌黑曲霉供試品對照組：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：（ ）CFU/平皿1

17、， （ ）CFU/平皿2陰性對照組：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：（ ）CFU/平皿1， （ ）CFU/平皿2檢驗人檢驗時間 年 月 日- 年 月 日復(fù)核人復(fù)核時間 年 月 日附件7:大腸埃希菌方法適用性檢查結(jié)果樣品批號：皿號麥康凱液體培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基檢驗結(jié)果試驗組12陽性對照組12陰性對照組12檢驗人檢驗時間 年 月 日- 年 月 日復(fù)核人復(fù)核時間 年 月 日附件8:沙門菌方法適用性檢查結(jié)果 樣品批號：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基RV沙門增菌液體培養(yǎng)基木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基檢查結(jié)果試驗組陽性菌對照組陰性菌對照組附件9:耐膽鹽革蘭陰性菌方法適用性檢查結(jié)果 樣品批號：腸道菌增菌液體培養(yǎng)基紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基結(jié)果判斷試驗組10-110-210-3陽性對照組陰性對照組附件10:驗證結(jié)果審批表驗證對象驗證開始日期驗證結(jié)束日期評審意見（在方框中打）1、驗證實驗有否遺漏 遺漏 未遺漏2、驗證實施過程中對驗證方案有無修改 有修改 無修改3、方案修