一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離鑒定及其亞硝化作用研究

1、農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，（）：一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離鑒定及其亞硝化作用研究王成林，周巧紅，王亞芬，梁威，吳振斌（中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢；中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京）摘要：從復(fù)合垂直流人工濕地表層基質(zhì)中分離出一株硝化活性較強(qiáng)的異養(yǎng)硝化細(xì)菌，進(jìn)行菌種鑒定，鑒定系統(tǒng)中沒(méi)有與該菌株特性相似的數(shù)據(jù)記錄。的序列分析結(jié)果顯示，菌株與產(chǎn)堿桿菌屬（）糞產(chǎn)堿桿菌（）有相似性，認(rèn)為分離菌株可能為。通過(guò)因素水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果顯示，當(dāng)溫度為，為，接種量為，溶氧時(shí)，該菌株亞硝化反應(yīng)效果最佳；影響亞硝化反應(yīng)效果的因素順序?yàn)椋喝苎鯗囟冉臃N量；溫度和溶氧影響極顯著，和接種量影響相對(duì)不顯著。

2、關(guān)鍵詞：人工濕地；異養(yǎng)硝化細(xì)菌；正交試驗(yàn)中圖分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：文章編號(hào)：（），（，；，）：，；，：；廢水生物脫氮是目前水處理領(lǐng)域關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。關(guān)于異養(yǎng)硝化作用，雖然目前仍有很多機(jī)理未得到解釋，對(duì)一些現(xiàn)象的解釋也不盡圓滿，但異養(yǎng)硝化作用的重要性日益受到關(guān)注。相對(duì)于自養(yǎng)硝化菌而言，異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分解效率較低，但是由于它們?cè)诃h(huán)境中的數(shù)量以及生長(zhǎng)速率上往往遠(yuǎn)大于自養(yǎng)菌，收稿日期：基金項(xiàng)目：國(guó)家“十五”科技項(xiàng)目（）；國(guó)家杰出青年基金項(xiàng)目（）；湖北省科技攻關(guān)重大項(xiàng)目（因此在某些環(huán)境之中，異養(yǎng)硝化細(xì)菌作用的貢獻(xiàn)可以與自養(yǎng)菌相當(dāng)。在人工濕地系統(tǒng)中，微生物的硝化、反硝化作用在氮的去除中有重要作用，根據(jù)報(bào)道

3、人工濕地系統(tǒng)對(duì)氮的去除，從貢獻(xiàn)上看依次為：微生物降解基質(zhì)吸附植物的吸收。硝化作用是指將氧化為的生物化學(xué)反應(yīng)，包括亞硝化反應(yīng)和硝化反應(yīng)兩個(gè)步驟。本試驗(yàn)擬從人工濕地系統(tǒng)中分離能進(jìn)行異養(yǎng)硝化反應(yīng)的菌株，并通過(guò)正交試驗(yàn)試圖找出影響亞硝化反應(yīng)效果的主要因素和最佳條件，從微生物角度來(lái)說(shuō)，豐富了高效菌種庫(kù)，為提高濕地處理效率和強(qiáng)化濕地的功能提供技術(shù)支持，）作者簡(jiǎn)介：王成林（），男，湖北浠水人，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。：通訊作者：吳振斌：第卷第期農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)并為濕地人工強(qiáng)化技術(shù)提供了理論依據(jù)。材料和方法采樣位點(diǎn)取自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所復(fù)合垂直流人工濕地系統(tǒng)表層基質(zhì)，采樣方法采用梅花布點(diǎn)法，樣

4、品混合后立即置于下保存。；：，其中包括。反應(yīng)體系為（），正反向引物各（緩沖液，），×（），聚合酶（），無(wú)菌去離子水，；各成分充分混合后，進(jìn)行如下反應(yīng)：預(yù)變性，再進(jìn)行個(gè)循環(huán)，變性，復(fù)性，延伸，最后延伸異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離篩選選擇性培養(yǎng)基組成乙酰胺，。產(chǎn)物用瓊脂糖進(jìn)行電泳，染色，掃描成像。結(jié)果分析：序列同源性分析在（）網(wǎng)站參（：）采用軟件檢索?？夹蛄腥∽?，（，用蒸餾水定容至，。富集培養(yǎng)取基質(zhì)樣品于盛有滅菌選擇性培養(yǎng)液的錐形瓶中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)，溫度設(shè)置為，轉(zhuǎn)速。），（）等數(shù)據(jù)庫(kù)。并將搜尋到的同源序列用軟件進(jìn)行序列排序，然后用軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和分析。細(xì)菌的分離與純化吸取富集

5、培養(yǎng)液加入到盛有無(wú)菌蒸餾水的錐形瓶中，于恒溫振蕩器上以轉(zhuǎn)速，在下振蕩，進(jìn)行稀釋涂布，于進(jìn)行次純化與分離。形成生化培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。單菌落后，依據(jù)不同的形態(tài)、質(zhì)地、邊緣、光學(xué)特性和顏色，初選出株純菌株，斜面保存，用于進(jìn)一步硝化活性檢驗(yàn)。異養(yǎng)硝化細(xì)菌硝化效果的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)樣品的配備挑取一接種環(huán)細(xì)菌菌苔于上述液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，在無(wú)菌條件下取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)菌液以的轉(zhuǎn)速離心，去除上清液，用無(wú)菌水沖洗后再離心，重復(fù)次，最后用無(wú)菌水配成的菌懸液用于試驗(yàn)定量接種備用。正交試驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)溶液配方為了研究純化菌株在好氧條件下的亞硝化作用效果，進(jìn)行亞硝態(tài)氮監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用培養(yǎng)基的具體配比見(jiàn)表。硝化活性驗(yàn)證將斜面上生

6、長(zhǎng)的菌苔用接種環(huán)挑取適量接種用于硝化活性鑒定，將具有硝化活性的細(xì)菌用石蠟液封保藏備用。控制因素選擇本試驗(yàn)為了研究異養(yǎng)硝化細(xì)菌亞硝化作用效果，設(shè)計(jì)（）正交試驗(yàn)，共因素：溫度、接種量和、溶解氧，分別編號(hào)為、，取個(gè)水平：溫度（）取菌種鑒定分析采用美國(guó)產(chǎn)微生物全自動(dòng)分析儀，挑選一株硝化活性較強(qiáng)的細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定。序列分析用方法提取該細(xì)菌的，并進(jìn)行擴(kuò)增。細(xì)菌通用引物序列：、，取、，接種量取，溶氧（）、。試驗(yàn)裝置和監(jiān)測(cè)方法試驗(yàn)主體裝置為個(gè)可控溫?fù)u床，個(gè)表營(yíng)養(yǎng)溶液成分配比列表王成林等：一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離鑒定及其亞硝化作用研究年月錐形瓶，編號(hào)，為空白樣品，用于亞硝化效果測(cè)定的營(yíng)養(yǎng)溶液配方見(jiàn)表，營(yíng)養(yǎng)溶液在接

7、種前為無(wú)菌。按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案要求，將個(gè)樣品分到個(gè)可控溫?fù)u床中培養(yǎng)，標(biāo)按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定，亞硝化反應(yīng)速率為單位時(shí)間濃度的改變。）有下列菌種：糞產(chǎn)堿桿菌（）；皮氏產(chǎn)堿桿菌（）；木糖氧化產(chǎn)堿桿菌脫硝亞種（）；木糖氧化產(chǎn)堿桿菌木糖氧化亞種（）；真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌（）；廣泛產(chǎn)堿桿菌（）；從基因序列分爭(zhēng)論產(chǎn)堿桿菌（）。析結(jié)果來(lái)看，作者從人工濕地中分離的一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌屬于產(chǎn)堿桿菌屬，一般認(rèn)為凡是序列同源性大于的兩株細(xì)菌即可確定為同一種，在本試驗(yàn)中測(cè)試的株菌與糞產(chǎn)堿菌序列同源性大于，所以認(rèn)為從人工濕地中分離的一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌屬于產(chǎn)堿桿菌屬糞產(chǎn)堿菌種。結(jié)果與討論菌株分離與微生物全自動(dòng)分析儀鑒定結(jié)果從株純化菌

8、株中檢驗(yàn)出兩株具有硝化活性的異養(yǎng)硝化菌，編號(hào)為、，通過(guò)硝化活檢驗(yàn)中的顯色反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)活性較強(qiáng)。微生物全自動(dòng)分析儀結(jié)果顯示微生物鑒定系統(tǒng)中沒(méi)有與菌株特性相似的數(shù)據(jù)記錄。作者將碳源利用情況建立指紋檔案，進(jìn)一步用分子手段進(jìn)行分析以期找出更多該菌種的信息。正交試驗(yàn)結(jié)果分析溫度的影響從圖可看出，在亞硝化反應(yīng)中，是該菌株亞硝化速率趨勢(shì)改變的分界點(diǎn)，當(dāng)溫度在時(shí)，亞硝化效果達(dá)到最佳。符合提出硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)速率和溫度之間的關(guān)系，（，）（）基因序列分析經(jīng)檢索，所篩選菌株和（）有的同源性，因此作者初步認(rèn)為本研究分離得到的一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌屬于產(chǎn)堿桿菌屬糞產(chǎn)堿菌種，又選擇了多種產(chǎn)堿桿菌屬的全序列：（），大多數(shù)硝化細(xì)菌的合

9、適生長(zhǎng)溫度在之間，低于或高于硝化細(xì)菌生長(zhǎng)和硝化作用減慢。因此溫度對(duì)硝化細(xì)菌生長(zhǎng)和亞硝化反應(yīng)速率有很大影響。（），（），（）進(jìn)行系統(tǒng)分析（見(jiàn)圖），結(jié)果也顯示該菌株和產(chǎn)堿桿菌屬糞產(chǎn)堿桿菌顯示出更高的同源性。等報(bào)道糞產(chǎn)堿桿菌為異養(yǎng)硝化細(xì)菌，該菌在低碳條件下進(jìn)行硝化作用，也可以在有機(jī)環(huán)境中進(jìn)行硝化作用。根據(jù)伯杰鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)介紹，產(chǎn)堿桿菌屬（的影響從圖可看出，在亞硝化反應(yīng)中，隨著升高，亞硝化速率先升后降，當(dāng)時(shí)，亞硝化反應(yīng)效果達(dá)到最佳。是影響亞硝化作用重要環(huán)境因素之一，在中性或微堿性下，亞硝化反應(yīng)過(guò)程迅速，若進(jìn)一步升高，從平衡關(guān)系中知道，濃度會(huì)迅速提高。由于硝化菌對(duì)氨很敏感，從而會(huì)圖基于構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

10、第卷第期亞硝化反應(yīng)速率農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)在，低于，則硝化作用趨于停止，在遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于時(shí)，溶解氧濃度對(duì)亞硝化反應(yīng)的影響不予考慮。從圖可看出，溶解氧水平的變化對(duì)亞硝化反應(yīng)速率的影響較大。亞硝化作用效果分析由表最優(yōu)組合結(jié)果可看出：當(dāng)溫度為，為，接種量為，溶氧時(shí)，亞硝化反應(yīng)效果最佳。在他的研究基礎(chǔ)上總結(jié)出了異養(yǎng)硝化菌在進(jìn)行硝化作用時(shí)的代謝通式，包括無(wú)機(jī)氮硝化代謝途徑（即）和有機(jī)氮硝化代謝途徑（即因素水平圖亞硝化反應(yīng)速率在因素水平條件下變化趨勢(shì)圖影響到亞硝化作用速率。），本試驗(yàn)異養(yǎng)硝化菌在進(jìn)行硝化作用時(shí)的代謝通式是，其中接種量的影響從圖可看出，在亞硝化反應(yīng)過(guò)程中，隨著接種量增加，亞硝化反應(yīng)速率降低，硝化細(xì)菌繁

11、殖的速率極大地受到營(yíng)養(yǎng)條件和所處環(huán)境的影響，基數(shù)大，營(yíng)養(yǎng)條件不同，不一定繁殖速度快。本試驗(yàn)接種量較小時(shí)，亞硝化速率較大，接種量較大時(shí)，亞硝化速率較小，可能接種量剛好處在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)限制的范圍內(nèi)。接種量小反而利于異養(yǎng)硝化細(xì)菌生長(zhǎng)，接種量大，由于營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，不利于異養(yǎng)硝化細(xì)菌生長(zhǎng)。途徑反映了亞硝化作用，無(wú)機(jī)態(tài)氮的形態(tài)轉(zhuǎn)化由異養(yǎng)硝化菌在進(jìn)行硝化作用時(shí)的代謝情況決定。研究濕地菌株亞硝化反應(yīng)效果最佳條件，進(jìn)一步探索如何提高全程硝化反應(yīng)效率，將對(duì)如何人為控制人工濕地運(yùn)行條件及提高人工濕地高氨氮廢水去除效果提供參考和理論依據(jù)。由表、表可看出：亞硝化反應(yīng)中，溶氧對(duì)亞硝化反應(yīng)效果影響最大，其次是溫度和，而接種量影響較

12、小，溫度和溶氧影響高度顯著，和接種量不顯著。一般的潛流濕地，污水主要經(jīng)過(guò)厭氧環(huán)境，在處理氨氮含量高的污水時(shí)往往因?yàn)橄趸饔貌蛔?，不能將氨氮充分轉(zhuǎn)化為反硝化作用的原料硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮，從而限制了濕地的除氮能力。復(fù)合垂直流人工濕地的結(jié)構(gòu)以及下行流至上行流的水流方式，形成了基質(zhì)床內(nèi)好氧厭氧的溶解氧狀態(tài)變化，從而保證了硝化作用反硝化作用的充分進(jìn)行，利于污水的高效脫氮，濕地的表層微生物具有較強(qiáng)的硝化作用，也是硝化作用作為氮素主要作用途徑的基質(zhì)。由影溶解氧的影響從圖可看出，在亞硝化反應(yīng)中，隨著升高，亞硝化反應(yīng)速率先升后降，當(dāng)溶解氧為時(shí)，亞硝化反應(yīng)效果達(dá)到最佳。硝化細(xì)菌為了獲得足夠的能量用于生長(zhǎng)，必需氧

13、化大量的和，環(huán)境中的溶解氧濃度大小會(huì)極大地影響亞硝化反應(yīng)速度和硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)速率，溶解氧濃度與硝化細(xì)菌生長(zhǎng)速率公式為（）（），從公式可知，當(dāng)增大時(shí)，硝化細(xì)菌生長(zhǎng)速率增大，當(dāng)環(huán)境!時(shí)，。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為溶氧應(yīng)控制表試驗(yàn)結(jié)果方差分析注：表示極顯著，表示相對(duì)不顯著。王成林等：一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離鑒定及其亞硝化作用研究境科學(xué)，（）：年月響因素排序和顯著性可知，溶氧和溫度對(duì)亞硝化反應(yīng)的影響最大，提高濕地表層溶解氧和控制合適的溫度，能夠提高濕地的硝化效率和處理高含量氨氮污水的能力。因此為了提高氨氮的去除率，可以考慮把主要影響因素選出，控制好條件，忽略次要影響因素，從而在強(qiáng)化人工濕地功能的條件選擇上提供指導(dǎo)

14、，避免造成浪費(fèi)。，（）：，（）：中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所微生物室編著土壤微生物研究方法科學(xué)出版社出版，結(jié)論（）用傳統(tǒng)微生物方法從復(fù)合垂直流人工濕地中分離篩選出一株硝化活性較強(qiáng)的異養(yǎng)細(xì)菌，進(jìn)行，：，：，：編委會(huì)，水和廢水檢測(cè)分析方法（第三水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法版）北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，菌種鑒定，鑒定系統(tǒng)中沒(méi)有與該菌株特性相似的數(shù)據(jù)記錄，可能該菌株信息不在鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)一步采用分子方法，擴(kuò)增，經(jīng)，（）：檢索，該菌株和（）有的同源性，因此作者初步認(rèn)為本研究分離得到的一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌屬于產(chǎn)堿桿菌屬糞產(chǎn)堿菌種。（）通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)溫度為，為，接種量為，溶氧時(shí)，亞硝（），（）：李沛霖，李大平，何曉紅生物膜處理無(wú)機(jī)氨氮廢水及其好氧反硝化現(xiàn)象水處理技術(shù)，（）：化反應(yīng)效果最佳；亞硝化反應(yīng)中，溶氧對(duì)亞硝化反應(yīng)效果影響最大，其次是溫度和，而接種量影響較小，溫度和溶氧影響高度顯著，和接種量影響相對(duì)不顯著。因此將影響異養(yǎng)硝化細(xì)菌代謝的因素控制在一定值，可以達(dá)到最佳亞硝化效果，控制好主要影響因素和條件，可以提高濕地的硝化效率和降低