Apoptin原核表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)

1、Apoptin原核表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)         11-01-09 15:32:00     編輯：studa20                     作者：王健生，張明鑫，段小藝，      &

2、#160;      王崢，周蘇娜，張廣健，王全穎，楊廣笑  【摘要】  目的 構(gòu)建Apoptin的原核表達(dá)載體，并制備抗原物質(zhì)Apoptin融合蛋白。方法 在獲得Apoptin融合基因的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了Apoptin的高效原核表達(dá)載體pET-28a(+)-Apoptin，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)受體菌中，以IPTG對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析目的蛋白。結(jié)果 轉(zhuǎn)化有Apoptin的原核表達(dá)載體pET-28a(+)-Apoptin的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘

3、導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對分子質(zhì)量約17 000的位置出現(xiàn)目的蛋白條帶，大小與Apoptin融合蛋白一致。結(jié)論 Apoptin原核表達(dá)載體pET-28a(+)-Apoptin能夠表達(dá)出Apoptin融合蛋白，為進(jìn)一步的Apoptin研究和制備Apoptin抗體奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  Apoptin 原核表達(dá)載體 pET-28a(+) 大腸桿菌ABSTRACT: Objective  To construct an Apoptin prokaryotic vector, aiming to produce antigenic fusion protein Apo

4、ptin. Methods  The Apoptin gene was amplified from the template of plasmid pSSCHG/NT4-Apoptin- HA2-TAT by PCR. The Apoptin was sub-cloned into the multiple clone sites of plasmid pET-28a (+) to get the prokaryotic vector of pET-28a (+)-Apoptin, which was transformed into E.coli BL21 (DE3). Expr

5、ession of E.coli BL21 (DE3) was induced by IPTG. The specific protein expression was detected by SDS-PAGE. Results  The fusion protein was expressed with high efficiency in E.coli BL21 (DE3) transformed by pET-28a (+)-Apoptin after induction with IPTG. The specific fusion protein had an apparen

6、t related molecular weight of about 17 000 ku as indicated by SDA-PAGE analysis. Conclusion  The Apoptin prokaryotic expression vector with pET-28a (+)-Apoptin can effectively express Apoptin fusion protein, laying a foundation for further study of Apoptin and preparation of antibodies against

7、Apoptin.KEY WORDS: Apoptin; prokaryotic expression vector; pET-28a (+); E.coli目的基因或載體對正常組織的毒性和腫瘤細(xì)胞對治療的耐受等是限制腫瘤基因治療臨床應(yīng)用的瓶頸。Apoptin(凋亡素)的發(fā)現(xiàn)突破了上述瓶頸，給抗腫瘤的基因治療帶來了轉(zhuǎn)機(jī)。Apoptin是雞貧血病毒(chicken anemia virus, CAV)的vp3基因編碼的蛋白質(zhì)，體外合成或基因工程表達(dá)的Apoptin能特異的引起多種人源性惡性腫瘤細(xì)胞凋亡，對正常二倍體體細(xì)胞無作用；且這種選擇性凋亡作用既不依賴于p53的介導(dǎo)，也不被bcl-2過表達(dá)所抑

8、制1，顯示其可能在腫瘤基因治療中具有迷人的應(yīng)用前景。本實驗在獲得CAV Apoptin基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建Apoptin的原核表達(dá)載體(圖1)，為下一步表達(dá)特異性蛋白產(chǎn)物、制備Apoptin抗體奠定基礎(chǔ)2。1  材料與方法1.1  質(zhì)粒、菌株、工具酶及試劑  含Apoptin全基因組序列的體外克隆NT4-Apoptin-HA2-TAT重組腺相關(guān)病毒由本課題組構(gòu)建2；大腸桿菌Top10、大腸桿菌BL21均來自西安華廣生物工程公司；質(zhì)粒pGEM-T Easy購自Promega公司；質(zhì)粒pET-28a(+)購自Novegen公司；限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶購自華美生物公司

9、；T4 DNA 連接酶購自MBI公司；主要試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。1.2  引物的設(shè)計和合成 根據(jù)前期研究的Apoptin基因序列的結(jié)果2，按照載體上正確的插入方向和譯讀框架設(shè)計一對引物。引物的5端分別添加了限制性內(nèi)切酶EcoR和Xho的酶切序列。擴(kuò)增的片段包括Apoptin完整的基因序列。上游引物：5-GGAATTCATGAACGCTCTCCAAGAAG-3；下游引物：5-GCTCGAGTCACAGTCTTATACGCCTTCTTG-3(下劃線處分別為EcoR和Xho的酶切序列)，由上海生工生物工程公司負(fù)責(zé)合成，用PAGE純化。1.3  目的基因的擴(kuò)增和純化&#

10、160;以含有Apoptin全基因組序列的pSSCHG/NT4-Apoptin-HA2-TAT為模板，上下游引物各50 pmol，10×PCR反應(yīng)緩沖液10 L，10 mmol/L dNTPs 2 L，加超凈水至終體積為49 L。94 預(yù)變性5 min、94 變性1 min、50 退火1 min后，再加入1 L Taq DNA聚合酶。進(jìn)行94 變性1 min、50 退火1 min、72 延伸1.5 min 30個循環(huán)，72 繼續(xù)延伸5 min。經(jīng)酚/氯仿抽提，無水乙醇沉淀，70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌沉淀后用30 L TE充分溶解沉淀。取少量PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，

11、并在紫外線測定A260值對產(chǎn)物進(jìn)行定量。1.4  重組質(zhì)粒pGEM-T Easy/Apoptin(pT/Apoptin)的構(gòu)建與鑒定 取上述PCR產(chǎn)物600 ng(0.2 g/L)、質(zhì)粒pGEM-T Easy 25 ng(50 g/L)、T4DNA連接酶5 u(5 u/L)、10×T4 DNA連接酶緩沖液2.5 L以及去離子水18 L(總體積25 L)建立連接反應(yīng)體系，23 水浴1h。取10 L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 L感受態(tài)大腸桿菌Top10，涂布LB(Amp+)平皿，37 倒置過夜。從LB平皿中挑選單菌落用堿裂解法，經(jīng)EcoR酶切后瓊脂糖凝膠電泳，篩選出正確重組質(zhì)

12、粒進(jìn)行大量制備。對含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序(上海生工生物工程公司)。1.5  重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Apoptin的構(gòu)建和鑒定將測序正確的重組質(zhì)粒pGEM-T Easy/Apoptin、pET-28a(+)分別進(jìn)行EcoR和Xho雙酶切后，各取1 L酶切產(chǎn)物、1 LT4DNA連接酶、10×T4DNA連接酶緩沖液2.5 L、去離子水18.5 L(總體積25 L)，16 水浴過夜。取10 L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 L感受態(tài)大腸桿菌Top10，涂布LB(Kan+)平皿，37 倒置過夜。從LB平皿中挑選單菌落用堿裂解法，經(jīng)EcoR和Xho酶切后瓊脂糖凝膠電泳，篩選出正確重組質(zhì)粒進(jìn)行大量制備。1.6  重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Apoptin在大腸桿菌中的表達(dá) 用重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Apoptin轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)受體菌，同時用質(zhì)粒pET28a(+)轉(zhuǎn)化BL21菌作對照。分別挑取單個陽性菌落接種入5 mL L