β—胡蘿卜素和番茄紅素提取分離與測(cè)定

1、胡蘿卜素和番茄紅素提取分離與測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)從天然產(chǎn)物中提取有機(jī)化合物的方法。2、學(xué)習(xí)用薄層層析法檢驗(yàn)有機(jī)化合物的基本原理，點(diǎn)樣，展開和計(jì)算Rf值的方法。 二儀器和試劑儀器三角瓶（50ml）、分液漏斗（150ml）、蒸餾瓶（50ml）、普通蒸餾裝置（或減壓蒸餾裝置）、漏斗、色譜柱、硅膠薄層板、量筒、燒杯、層析缸。試劑胡蘿卜、丙酮、石油醚（bp3060）、硅膠（層析用，200300 目）、無水硫酸鈉、石油醚（bp6090）、丙酮：石油醚（1：9）（V/V）。三實(shí)驗(yàn)方案1、含類胡蘿卜素石油醚溶液的制備將新鮮胡蘿卜洗凈、擦干,切去尾部，切碎。稱取碎鮮胡蘿卜【1】10g 于小研缽中,研碎。碎胡

2、蘿卜移至50mL 三角燒瓶中，每次用丙酮10mL 萃取2 次，再用石油醚（bp3060）萃取固體兩次，每次10mL。把石油醚溶液加到丙酮液中。在分液漏斗中將混合液與50mL飽和氯化鈉溶液【2】振蕩，分去下層，用蒸餾水洗滌上層液兩次，每次50mL，分去水，用無水硫酸鈉干燥石油醚液（約1h）,把混合液倒入50mL 圓底燒瓶中，熱水浴加熱蒸餾，除去溶劑，得固體。在制得的固體物加入3mL 石油醚（bp6090）拌硅膠1g，在通風(fēng)櫥內(nèi)抽干，得黃色硅膠顆粒，待上柱。2、裝柱和分離取20cm*1cm 色譜柱一根，垂直裝置，以50ml 三角燒瓶作洗脫液的接受器。用鑷子取少許脫脂棉【3】放于干凈的色譜柱底部，輕

3、輕塞緊，再在脫脂綿上蓋一層厚0.5cm 的海石砂（或用一張比柱內(nèi)徑略小的濾紙代替），關(guān)閉活塞，向柱內(nèi)倒入石油醚（bp6090）至約為柱高的34 處，打開活塞，控制流出速度為1 滴/s。通過一干燥的玻璃漏斗慢慢加入層析硅膠。用洗耳球輕輕敲打柱身，使填裝緊密。當(dāng)裝填到3/4 時(shí)，再在上面加一層0.5cm 厚的海石砂，操作時(shí)一直保持上述流速，注意不能使液面低于砂子的上層。當(dāng)液面流至離海石砂面1cm 時(shí)，立即從玻璃漏斗加入已制備好的含胡蘿卜素的黃色硅膠，隨后用0.5ml 石油醚洗下管壁的硅膠，如此連續(xù)23 次，直至洗凈為止，然后在色譜柱上裝上滴液漏斗，用石油醚（bp6090）作洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗1 滴

4、/s。當(dāng)有一黃色的譜帶分出，待黃色組分絕大部分洗出時(shí)，把洗脫劑換成1：9 丙酮一石油醚（bp6090）混液作洗脫劑進(jìn)行洗脫，控制流出速度如前（這混液洗脫劑有助于混合物中極性較大的組分移動(dòng)），又可分出兩個(gè)黃色組分。在4590min 內(nèi)，柱中物料將全部洗脫出來。觀察這些物料通過柱子的移動(dòng)情況。在三角燒瓶中收集3 份洗出液。用紙色譜、薄層色譜對(duì)各段洗出液進(jìn)行色譜分析。3.薄層色譜法樣品：柱色譜法中洗脫出的份樣品液展開劑：1：9 丙酮一石油醚溶液薄層板的制備：取3 片載波體，洗凈，晾干。在50ml 燒杯中放置3g 硅膠G，逐漸加入0.5%cmC 水溶液8ml，調(diào)成均勻的糊狀，將此糊狀物傾于上述潔凈的載

5、玻片圣桑，用手將帶漿的載玻片在水平的桌面上做上下輕微的顫動(dòng)，并不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)方向，制成厚薄均勻，表面光潔的平整的薄層板，然后放在水平桌面上，在室溫放置晾干后放入烘箱中，緩慢升溫至110，恒溫0.5h，取出，稍冷后置干燥器中備用。點(diǎn)樣：取出上述制好的薄層板，分別在距一端點(diǎn)1cm 處用鉛筆輕輕劃一橫線作為起始線。用毛細(xì)管吸取少量樣品液，在一塊板的起點(diǎn)線上點(diǎn)第一個(gè)色帶的樣品液，根據(jù)柱色譜分離的色帶，依次點(diǎn)樣，如果樣點(diǎn)顏色較淺，可重復(fù)點(diǎn)樣，重復(fù)點(diǎn)樣前必須待前次樣點(diǎn)揮干后進(jìn)行。樣點(diǎn)直徑不超過2mm。展開：待樣點(diǎn)干燥后，小心地放入已加入展開劑的250ml 廣口瓶中進(jìn)行展開。在瓶的內(nèi)壁貼一張高5cm，環(huán)繞周長(zhǎng)4/

6、5 的濾紙，下面浸入展開劑中，以使容器內(nèi)被展開劑蒸氣飽和。點(diǎn)樣一端浸入展開劑0.5cm（樣點(diǎn)不浸泡在展開劑中）。蓋好瓶塞，觀察展開劑前沿上升離板的上端1cm 處取出，盡快用鉛筆在展開劑上升的前沿處劃一記號(hào)，晾干后，量出展開劑和樣點(diǎn)移動(dòng)的距離，計(jì)算Rf 值。四、注意事項(xiàng)1，本實(shí)驗(yàn)采取的工藝不同于其他工藝，體現(xiàn)在原料粉碎時(shí)加入了穩(wěn)定劑（5ml 氨水和35ml 乙醇）來防止胡蘿卜素被氧化，由此可提高提取率。2、色譜柱填裝緊密與否，對(duì)分離效果很有影響。若柱中留有氣泡或各部分松緊不勻（更不能有斷層或暗溝）時(shí)，會(huì)影響滲濾速度和顯色的均勻。但如果填裝時(shí)過分敲擊，又會(huì)因太緊密而流速太慢。3、加入砂子的目的是。

7、在加料是不致把吸附劑沖起，影響分離效果。4、為了保持色譜柱的均一性，使整個(gè)吸附劑浸泡在溶液或溶液中是必要的。否則當(dāng)柱中溶液流干時(shí)。柱身干裂，影響滲濾和顯色的均一性。5、若不用滴液漏斗，也可用每次倒入10ml 洗脫劑的方法進(jìn)行洗脫6、載玻片上涂層要均勻，既不應(yīng)有紋路、帶團(tuán)粒，也不應(yīng)有能看到玻璃的薄涂料點(diǎn)。7、點(diǎn)樣用的毛細(xì)管必須專用，不得弄混。8、點(diǎn)樣時(shí)，使毛細(xì)管液面剛好接觸到薄層（濾紙）既可，均勻點(diǎn)樣過重而使薄層破壞。從番茄中提取番茄紅素和胡蘿卜素1目的要求掌握色素提取方法、柱層析分離方法及薄層色譜初步定性方法。了解胡蘿卜素與番茄紅素性質(zhì)的差別。2方法原理番茄中含有番茄紅素和少量的胡蘿卜素，二者

8、均屬于類胡蘿卜素。類胡蘿卜素為多烯類色素，不溶于水而溶于脂溶性有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)先用乙醇將番茄中的水脫去，再用二氯甲烷萃取類胡蘿卜素。因?yàn)槎燃淄榕c水不混溶，故只有除去水分后才能有效地從組織中萃取出類胡蘿卜素。根據(jù)番茄紅素與胡蘿卜素極性的差別，用柱層析可以將它們分離。分離效果可以用薄層層析進(jìn)行檢驗(yàn)。3主要實(shí)驗(yàn)儀器及材料新鮮番茄（或番茄醬）。95乙醇，二氯甲烷，石油醚（6090），氯仿，中性或酸性氧化鋁（柱層析用），環(huán)己烷，硅膠G，飽和氯化鈉溶液，無水硫酸鈉。4掌握要點(diǎn)層析柱裝填與操作方法，薄層點(diǎn)樣與展開方法。5實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1）原料處理與色素提取稱取新鮮番茄漿20 g于100 mL圓底燒瓶中，加95乙

9、醇40 mL，搖勻，裝上回流冷凝管，在水浴上加熱回流5min，趁熱稠濾，只將溶液傾出，殘?jiān)粼谄績(jī)?nèi)，加入30 mL二氯甲烷，水浴上加熱回流5 min，冷卻，將上層溶液傾出抽濾，固體仍保留在燒瓶?jī)?nèi)，再加10 mL二氯甲烷重復(fù)萃取一次。合并乙醇和2次二氯甲烷提取液，倒入分液漏斗中，加5 mL飽和氯化鈉溶液（有利分層），振搖，靜止分層。分出橙黃色有機(jī)相，使其流經(jīng)一個(gè)在頸部塞有疏松棉花且在棉花上鋪一層1 cm厚的無水硫酸鈉的三角漏斗，以除去微量水分。將此溶液貯存于干燥的有塞子的錐形瓶中。層析之前，將此溶液在通風(fēng)櫥中用熱水浴蒸發(fā)至干。2）柱層析分離取一只長(zhǎng)15 cm左右內(nèi)徑為11.2 cm的層析柱，柱內(nèi)

10、裝有用石油醚調(diào)制的氧化鋁。將粗制的類胡蘿卜素溶解在4 mL苯中，用滴管在氧化鋁表面附近沿柱壁緩緩加入柱中（留1滴供以后的薄層層析用），打開活塞，至有色物料在柱頂剛流干時(shí)即關(guān)閉活塞。用滴管取幾毫升石油醚，沿柱壁洗下色素，并通過放出溶劑至柱頂流干，從而使色素吸附在柱上。然后加大量的石油醚洗脫，黃色的胡蘿卜素在柱中移動(dòng)較快，紅色的番茄紅素移動(dòng)較慢。收集洗脫液至黃色的胡蘿卜素從柱上完全除去，然后用極性較大的氯仿作洗脫劑洗脫番茄紅素（注意更換接受瓶）。將收集到的兩個(gè)部分在通風(fēng)櫥內(nèi)用熱水蒸發(fā)至干。將樣品分別溶于盡可能少的二氯甲烷中，盡快進(jìn)行薄層層析。3） 薄層層析 在用硅膠G鋪成的薄板上距離底邊約1 cm

11、處，分別用毛細(xì)管點(diǎn)上3個(gè)樣品，中間點(diǎn)為未分離的混合物，兩邊分別點(diǎn)上分離得到的胡蘿卜素和番茄紅素?？梢远啻吸c(diǎn)樣，即點(diǎn)完一次，待溶劑揮發(fā)后再在原來的位置點(diǎn)樣。但要注意，必須在同一位置上點(diǎn)，而且樣品斑點(diǎn)盡量小。點(diǎn)樣時(shí)毛細(xì)管只要輕輕接觸板面即可，切不可劃破硅膠板。樣品之間的距離為11.5 cm。將此板放入樣裝有環(huán)己烷作展開劑的層析缸中，蓋上蓋子。切勿讓展開劑浸沒樣品斑點(diǎn)。待溶劑展開至10 cm左右時(shí)，取出層析板。因斑點(diǎn)會(huì)氧化而迅速消失，故要用鉛筆立即圈出。計(jì)算不同樣品的Rf值，比較不同樣品Rf值大小的原因以及分離效果。6實(shí)驗(yàn)思考題1）在本法中，柱層析和薄層層析的操作要點(diǎn)是什么？2）從其它原料提取的類乎

12、蘿卜色素，能應(yīng)用此方法分類類乎蘿卜素物質(zhì)嗎？3）能用此法分離類胡蘿卜素之外的哪些物質(zhì)？-胡蘿卜素和番茄紅素的提取、分離與測(cè)定摘要胡蘿卜素是一種抗氧化劑，具有解毒作用，是維護(hù)人體健康不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素。番茄紅素（Lycopene）是類胡蘿卜素的一種，對(duì)防治癌癥、提高免疫力、延緩衰老有特效，有植物黃金之稱，被譽(yù)為“21世紀(jì)保健品的新寵”。因此，提取、分離、鑒定這些活性成分成為研究和開發(fā)這些天然生物資源的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)用常規(guī)天然有機(jī)化合物的提取方法獲得-胡蘿卜素和番茄紅素樣品，再用柱色譜法將其分離，用薄層色譜檢測(cè)分離效果，最后用分光光度法分別對(duì)其鑒定。關(guān)鍵詞-胡蘿卜素、番茄紅素、提取、分離、測(cè)定實(shí)驗(yàn)

13、基本原理-胡蘿卜素和番茄紅素分子中的碳骨架是由8個(gè)異戊二烯單位連接而成的，它們是四萜類化合物。它們的分子中都有一個(gè)較長(zhǎng)的-共軛體系，能吸收不同波長(zhǎng)的可見光，因而，它們都呈現(xiàn)一定的綠色，-胡蘿卜素是黃色物質(zhì)，番茄紅素是紅色物質(zhì)，所以，又把它們叫做多烯色素。-胡蘿卜素和番茄紅素的結(jié)構(gòu)式分別如下:  （番茄紅素）（-胡蘿卜素）胡蘿卜素是最早發(fā)現(xiàn)的一種多烯色素。后來，又發(fā)現(xiàn)了許多在結(jié)構(gòu)上與胡蘿卜素類似的色素，于是就把這類物質(zhì)叫做胡蘿卜素類化合物，或者叫做類胡蘿卜素。這類化合物大都難溶于水，易溶于弱極性或非極性的有機(jī)溶劑，因此又把這類化合物叫做脂溶性色素。胡蘿卜素廣泛存在于植物的葉、

14、花、果實(shí)中，尤以胡蘿卜中含量最高。胡蘿卜素有、三種異構(gòu)體，在生物體中以-異構(gòu)體含量最多，生理活性最強(qiáng)。在動(dòng)物體中，胡蘿卜素在酶的作用下可轉(zhuǎn)化為維生素A，因此，胡蘿卜素又被叫做維生素A原。胡蘿卜素在人和高等動(dòng)物體內(nèi)就有重要的生理功能，是人和高等動(dòng)物生存不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。番茄紅素是胡蘿卜素的開鏈異構(gòu)體。番茄紅素在成熟的紅色植物果實(shí)如番茄、西瓜、胡蘿卜、草莓、柑橘等中含量豐富，其中含量最高的是番茄。由于番茄紅素不具有維生素A原活性，因此長(zhǎng)期以來不被人們所重視。但近年來研究表明，番茄紅素是一種優(yōu)越的天然色素和生物抗氧化劑，具有極強(qiáng)的清除自由基的能力，它可以預(yù)防前列腺癌、乳腺癌和消化道（結(jié)腸、直腸與胃

15、）癌的發(fā)生，在預(yù)防心血管疾病、動(dòng)脈硬化等各種與衰老有關(guān)的疾病及增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面具有重要作用。正因如此，近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)番茄紅素的研究方興未艾，不僅有大量的研究文章公開發(fā)表，而且還有一些相關(guān)產(chǎn)品面市。番茄紅素作為新型保健食品、食品添加劑、化妝品和藥品具有廣闊的市場(chǎng)前景。-胡蘿卜素和番茄紅素的分子式均為C40H56，分子量為536.85，-胡蘿卜素的熔點(diǎn)是184，番茄紅素的熔點(diǎn)是174。-胡蘿卜素和番茄紅素是不飽和碳?xì)浠衔?，難溶于甲醇、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、正己烷、丙酮，易溶于氯仿、二硫化碳、苯等有機(jī)溶劑。根據(jù)-胡蘿卜素和番茄紅素的上述性質(zhì)，可利用石油醚、乙酸乙酯等弱極性溶劑將它們從植物材料

16、中浸提出來。然后，根據(jù)它們對(duì)吸附劑吸附能力的差異，用柱色譜進(jìn)行分離，用薄層色譜檢測(cè)分離效果。并根據(jù)它們?cè)诳梢姽鈪^(qū)有強(qiáng)烈吸收的性質(zhì)，用紫外可見分光光度法進(jìn)行測(cè)定，-胡蘿卜素的最大吸收峰為451nm ，番茄紅素的最大吸收峰為472nm 。實(shí)驗(yàn)儀器與試劑儀器：三角瓶（50ml）、分液漏斗（150ml）、蒸餾瓶（50ml）、普通蒸餾裝置（或減壓蒸餾裝置）、色譜柱、硅膠薄層板、量筒、燒杯、試管、721分光光度計(jì)、層析缸。試劑：番茄（或番茄醬）或胡蘿卜、食鹽、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（6090）、乙醇、污水硫酸鎂、氧化鋁（層析用，100200目）、硅膠（層析用，200300目）、無水硫酸鈉、石油醚（6090

17、）：乙醇（2：1，V/V）、石油醚：丙酮（3：2，V/V）。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟1、類胡蘿卜素的提?。海?）稱取10g 新鮮番茄果肉，搗碎，置于50ml 三角瓶中，再加2.5g 食鹽，用玻璃棒攪拌，使食鹽與番茄果肉充分混合均勻，靜置一定時(shí)間，便會(huì)看到果肉組織中有大量水分滲出。脫水時(shí)間持續(xù)2030min 。隨后將脫除下來的水分濾入150ml 分液漏斗中。（2）向經(jīng)過食鹽脫水的番茄果肉中加入5ml 丙酮，用玻璃棒攪拌，并靜置510min 。然后將丙酮提取液也濾入分液漏斗中。（3）向經(jīng)過丙酮處理的番茄果肉中加入5ml 乙酸乙酯浸提5min 。浸提過程中應(yīng)不時(shí)振搖三角瓶，使番茄果肉與溶劑充分接觸；若室溫過低

18、，可將三角瓶置于溫水浴中加熱，但應(yīng)注意不能使浸提溶劑明顯揮發(fā)損失。5min 后將提取液也濾入漏斗中，并用玻璃棒輕壓殘?jiān)M量使溶劑流盡。再用乙酸乙酯重復(fù)浸提2次，每次5ml ，合并提取液至分液漏斗中。（4）充分振搖分液漏斗中的混合溶液，靜置，完全分層后，棄去水層，有機(jī)層（脂層）再用蒸餾水洗2次，每次810ml ，棄去水層。脂層自分液漏斗上口倒入干燥的小三角瓶中，加入適量的無水硫酸鎂（或無水硫酸鈉）遮光干燥15min 。（5）干燥后的脂層濾入50ml 干燥的蒸餾瓶中，水浴加熱，小心蒸餾（最好減壓蒸餾），濃縮至12ml 。所得濃縮夜即為-胡蘿卜素樣品。2、 類胡蘿卜素的柱色譜分離：選一支1.5*20

19、cm 的色譜柱，用適量層析用氧化鋁（100200目）作吸附劑干法裝柱，高度約10cm ，要求緊密勻?qū)?。分離方式為梯度洗脫，第一步用石油醚（6090）洗脫。先沿色譜柱管壁滴加58ml 石油醚至柱體（各方向要均勻），待溶劑表面降至氧化鋁柱面頂端時(shí)，用滴管迅速地小心滴加510滴樣品至柱子中，待樣品液面即將在柱面上消失時(shí)，沿管壁小心滴加石油醚35滴，沖洗粘在管壁上的有色物質(zhì)。如此重復(fù)34次，直至管壁沖洗干凈為止。隨后，在管內(nèi)加入盡可能多的石油醚進(jìn)行洗脫，第一步收集到的洗脫液為黃色。待洗脫液清亮無色后用石油醚：丙酮（3：2，V/V）的混合液洗脫，第二步收集到的洗脫液為紅色。最后用丙酮將前兩步不能洗脫的剩余組分洗脫下來。分別收集第三步洗脫液，用薄層色譜檢測(cè)及分光光度法測(cè)定。3、 類胡蘿卜素的薄層色譜檢測(cè)：對(duì)前面得到的類胡蘿卜素樣品以及柱色譜分離得到的樣品分別進(jìn)行薄層分析，以檢查柱色譜分離效果。薄層層析板預(yù)先用硅膠G制備并活化（110，1小時(shí)），展開劑為石油醚：丙酮（3：2，V/V）。薄層分離后觀察斑點(diǎn)位置，計(jì)算各斑點(diǎn)的 Rf值，并明確各斑點(diǎn)歸