產木聚糖酶和纖維素酶真菌的酶學性質分析

1、生物工程食品研究與開發(fā)FoodResearchAndDevelopment2011年9月第32卷第9期179產木聚糖酶和纖維素酶真菌的酶學性質分析麥國琴，許曉萍，余翠媚，張立國，王娟*（深圳大學生命科學學院，廣東深圳518060）摘要：紅樹林土壤微生物資源豐富，從深圳福田紅樹林土壤中分離了80株真菌，經過產酶發(fā)酵復篩，獲得2株同時具有較高木聚糖酶和纖維素酶活的真菌。通過菌株形態(tài)觀察和分子鑒定，確定菌株1為草酸青霉（Penicilliumoxalicum），菌株2的木聚糖酶和菌株2為曲霉屬的Aspergilluspiperis。菌株1的木聚糖酶和纖維素酶酶活分別為42.16IU和3.05IU，纖

2、維素酶酶活分別為39.01IU和0.87IU。同時，對其進行酶學性質研究表明，2菌株木聚糖酶的最適溫度均為50；菌株1纖維素酶的最適溫度是60，菌株2纖維素酶的最適溫度是70，具有一定的耐熱性。兩菌株纖維素酶的最適pH均為3.0；菌株1木聚糖酶的最適pH為5.0，菌株2木聚糖酶的最適pH為4.0。關鍵詞：纖維素酶；木聚糖酶；土壤真菌；青霉；曲霉ScreeningofCellulaseandXylanase-pruducingFungifromMangroveSoilandCharacterizationoftheEnzymaticReactionsMAIGuo-qin，XUXiaoping，Y

3、UCuimei，ZHANGLiguo，WANGJuan*（CollegeoflifesciencesShenzhenuniversity，Shenzhen518060，Guangdong，China）Abstract:Mangroveecologicalsystemhasrichresourcesofmicroorganismsinthesoil.Eightystrainsoffunfiwereisolatedfrommangroveenvironment.Twostrainsofcellulaseandxylanase-pruducingfungiwereobtainedafterrescr

4、eeningfermentationforenzymeproduction.TheenzymeactivitiesofcellulaseandxylanaseofstrainNo.1is42.16IUand3.05IUrespectively.TheenzymeactivitiesofcellulaseandxylanaseofstrainNo.2is39.01IUand0.87IUrespectively.Theoptimumtemperatureofxylanaseoftwostrainsareall50.TheoptimumtemperatureofcellulaseofstrainNo

5、.1andNo.2are60and70respectively.TheoptimumpHofcellulaseoftwostrainsareallpH3.0.TheoptimumpHofxylanaseofstrainNo.1andNo.2arepH5.0andpH4.0respectively.StrainNo.1andNo.2wereidentifiedasPenicilliumoxalicumandAspergilluspiperisrespectivelybymorphologicobservationandtheresultofITSanalysis.Keywords:cellula

6、se；xylanase；soilfungi；Penicillium；Aspergillus纖維素是地球上分布最廣、蘊藏量最豐富的生物質,也是最廉價的可再生資源。纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協同作用，分解纖維素產生寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖1。纖維素酶可廣泛用于食品、紡織、飼料、釀酒、石油勘探、中藥成分提取等眾多領域，特別是在紡織、洗基金項目：深圳市南山區(qū)科技計劃項目（南科院0031）；深圳大學專題研究型教改項目（JG2010059）；深圳大學青年教師教改項目（JG2010111）作者簡介：麥國琴（1985），女（漢），碩士研究生，研究方向：海洋真菌功能酶

7、基因的克隆與表達。*通信作者滌、造紙和生物能源等工業(yè)應用上具有重要地位2。木聚糖是植物半纖維素的主要成分，是一種多聚五碳糖，且多以異質多糖形式存在，與纖維素分子之間存在氫鍵連接和物理混合。木聚糖酶是一類降解木聚糖分子的復雜酶系，包括內切1，4木聚糖酶、D木糖苷酶、L呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、酚酸酯酶等3。南海沿岸紅樹林資源豐富，紅樹林(mangrove)是熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落4。其生態(tài)系統(tǒng)是一個特殊復雜的生境，植物凋落物極其豐富，其中含有大量的纖維素、半纖維素等，紅樹林區(qū)絕大多數真菌都能產生降解纖維素和其他植物成分的酶5。目前，研180麥國琴，等：產木聚糖酶和纖維素酶

8、真菌的酶學性質分析生物工程究人員對陸地環(huán)境中的真菌研究較多6-8，而與紅樹林環(huán)境中真菌的分離鑒定、酶活及酶學性質分析等的相關研究相對較少。本研究從深圳福田紅樹林土壤環(huán)境中篩選高產纖維素酶、木聚糖酶的真菌菌株，并對其進行分子鑒定及酶學性質的研究。11.1材料與方法樣品來源樣品采自于深圳福田紅樹林表層015cm的土壤，每點采集樣品約10g。選擇10個采集點，1.2培養(yǎng)基1）馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基9：葡萄糖10g，蛋白胨5g，K2HPO41g，MgSO4H2O0.5g，瓊脂20g，海水750mL，加去離子水至1L，121滅菌30min，溫度降到50左鏈霉素（其終濃度均為50g/mL）。右，加入青霉素、2）

9、液體種子培養(yǎng)基：mandels營養(yǎng)鹽濃縮液100mL/L，mandels微量元素濃縮液10mL/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，1mol/L的檸檬酸緩沖液（pH45）50mL/L，吐溫801.5mL/L。3）纖維素酶產酶培養(yǎng)基：微晶纖維素粉30g/L，mandels營養(yǎng)鹽濃縮液200mL/L，mandels微量元素濃縮液1.0mL/L，葡萄糖3g/L，蛋白胨1g/L，1mol/L的檸檬）50mL/L，吐溫801.5mL/L。酸緩沖液（pH4.54）木聚糖酶產酶培養(yǎng)基：玉米芯粉30g/L，mandels營養(yǎng)鹽濃縮液200mL/L，mandels微量元素濃縮液1.0mL/L,葡萄糖3g/L，

10、蛋白胨1g/L，1mol/L的檸檬酸）50mL/L，吐溫801.5mL/L。緩沖液（pH4.51.31.3.1方法紅樹林土壤真菌的分離與篩選將采集的樣品分別用無菌水適當稀釋，涂布于馬37培養(yǎng)2d，挑取單菌落在馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基平板，丁氏瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線純化分離3次，得到純種的真菌。將純化菌株（無菌水洗孢子3mL）接種于含有30mL液體種子培養(yǎng)基的三角搖瓶中，于28，250r/min條件下振蕩培養(yǎng)2d后，再取3mL的液體種子接種于含有30mL產酶培養(yǎng)基的三角搖瓶中于28，250r/min條件下振蕩培養(yǎng)4d后分別檢測其木聚糖酶及纖維素酶酶活。1.3.2木聚糖酶酶活測定首先在試管中加入0.9mL0

11、.5%的木聚糖溶液（由0.05mol/LpH4.8的醋酸緩沖液配制）和0.1mL適當稀釋的酶液，50恒溫水浴20min后加入2mL3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑終止反應，煮沸5min，冷卻后測定其540nm下的吸光值，以木糖作標準。酶活定義：1mL酶液在50和pH4.8條件下，每分鐘水解木聚糖生成1mol木糖的量為1個酶活力單位，以IU表示。1.3.3纖維素酶活測定在試管中加入0.9mL1%的微晶纖維素溶液（由0.05mol/LpH4.8的檸檬酸緩沖液配制）和0.1mL適當稀釋的酶液，50恒溫水浴20min后加入2mLDNS試劑終止反應，煮沸5min，冷卻后測定其540nm下的吸光值，以葡

12、萄糖作標準。酶活定義：1mL酶液在50和pH4.8條件下，每分鐘水解纖維素生成1mol葡萄糖的量為1個酶活力單位，以IU表示。1.3.4最適pH和最適溫度的測定最適pH測定：配制pH1pH12的緩沖液，分別在pH1pH12條件下按照1.3.2及1.3.3方法測定木聚糖酶和纖維素酶活性。最適溫度測定：用pH4.8緩沖液配制底物，分別在1080條件下按照1.3.2及1.3.3方法測定木聚糖酶和纖維素酶活性。1.3.5法10。分子鑒定：提取真菌的基因組DNA,采用真菌5.8SrDNA通用引物ITS1及ITS411擴增菌株的5.8SrDNA-ITS（內部轉錄間隔區(qū)，internaltranscribe

13、rspacer）序列，測序，將所得序列與GenBank對PCR產物進行切膠回收、數據庫中序列進行tblastx分析比對。22.1結果與分析分離菌株概況深圳福田紅樹林土壤樣品經分離純化，在含抗生素的馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基上涂布、劃線、純化，共分離得到80株真菌。把這80株真菌分別接到液體種子培養(yǎng)基、產酶培養(yǎng)基上復篩，得到2株（菌株1和菌株2）同時具有較高木聚糖酶和纖維素酶活的真菌。經測定，菌株1的菌株木聚糖酶和纖維素酶活分別為42.16IU和3.05IU，2的木聚糖酶和纖維素酶活分別為39.01IU和0.87IU。2.22株紅樹林土壤真菌的形態(tài)觀察菌株1和菌株2在馬丁氏培養(yǎng)基上的菌落特征和分生孢子結構

14、見圖1。圖1a顯示，菌株1在馬丁氏培養(yǎng)基上28培養(yǎng)7d，直徑約60mm，中間有臍狀突起而其他部分平坦；質地絨狀；分生孢子大量產生；分生孢子面先是粉紅色，后來變成暗綠色，菌落反面為黃褐色。圖1b顯示，菌株2在直徑約65mm，平坦并具馬丁氏培養(yǎng)基上28培養(yǎng)7d，菌株的鑒定形態(tài)觀察方法參考乳酸石碳酸棉藍染色液染色生物工程麥國琴，等：產木聚糖酶和纖維素酶真菌的酶學性質分析181abcdb.菌株2的菌落特征；c.菌株1的分生孢子結構；d.菌株2的分生孢子結構。a.菌株1的菌落特征；圖1菌株的菌落特征及分生孢子結構Fig.1Characteristicsofcolonyandconidiastructur

15、eoftwostrains有輻射狀溝紋；質地絲絨狀，分生孢子大量產生，主要聚集在菌落的中部，為灰褐色，菌落反面呈淡黃色。經乳酸石碳酸棉藍染色液染色后，在40X光學顯微鏡下觀察結果如下：圖1c顯示，菌株1其分生孢子梗莖壁平；帚狀枝通常二輪生，偶有三輪生；梗基每輪24個，彼此較緊貼；分生孢子近似于橢圓形，分生孢子鏈圖1d顯示，菌株2其分生孢子囊為球形；分近于圓柱狀。生孢子梗老時黃色或黃褐色，壁平滑；頂囊球形；分生孢子近似于球形。2.32株紅樹林土壤真菌的分子鑒定利用真菌5.8SrDNA通用引物ITS1及ITS4，分別從菌株1和菌株2的基因組DNA中擴增出一條特異性片段，序列大約600bp。菌株1、

16、2的基因組DNA及5.8SITS圖3。PRC產物電泳圖分別見圖2、M.250bpmarker；1.菌株2的ITS序列；2.菌株1的ITS序列圖3兩菌株的ITS序列Fig.3ITSsequenceoftwostrainsXWSFJJ3（FJ977097）的相似性達到99.5%，同時結合形態(tài)觀察，可確定菌株1為草酸青霉（Penicilliumoxalicum）；菌株2的ITS序列與AspergilluspiperisstrainCBS112811（FJ629352）的相似性達到99.6%，結合形態(tài)觀察，可確定菌株2為曲霉屬的Aspergilluspiperis。2.4酶促反應最適溫度的測定在不同的

17、溫度條件下測定菌株1和菌株2的木聚糖酶活見圖4。M.DL15000marker；1.菌株2的基因組；2.菌株1的基因組。圖2兩菌株的基因組DNAFig.2GenomeDNAoftwostrains將擴增的ITS序列PCR產物進行切膠回收、測序，并把測序結果與GenBank數據庫中序列進行tblastx比對分析，菌株1的ITS序列與Penicilliumoxalicumstrain圖4木聚糖酶的最適溫度Fig.4Optimumtemperatureofxylanase由圖4可知，2種真菌的木聚糖酶活的最適溫度均182麥國琴，等：產木聚糖酶和纖維素酶真菌的酶學性質分析生物工程為50，酶活分別為42

18、.16IU和39.01IU；并且在4060范圍內都能保持67.1%以上的酶活，尤其菌株1在70下仍保持64.3%的酶活，說明該菌產生的木聚糖酶具有一定的耐熱性，有較好的應用潛能。在不同的溫度條件下測定菌株1和菌株2的纖維素酶活見圖5。圖7纖維素酶的最適pHFig.7OptimumpHvalueofcellulase不明顯，說明兩菌株均產生酸性纖維素酶。3結論與討論南海紅樹林產纖維素酶或木聚糖酶的土壤微生但對分離菌株的物廈門大學和海南大學已有報道12-13，圖5纖維素酶的最適溫度Fig.5OptimumtemperatureofcellulasepH等特性并未有詳細數據。我分子鑒定及最適溫度、們

19、應用分子生物學手段，對菌株進行了分子鑒定，并對相關酶學性質進行了研究。rDNA上的5.8、18和28SrDNA基因有極大的保守性，同時絕大多數的真核生物都有極為廣泛的序列多態(tài)性，即親緣關系非常接近的2個種都能在ITS序列上這就是ITS序列在表現出差異,顯示最近的進化特征，微生物種類鑒定的理論基礎14。從深圳福田紅樹林土木聚糖酶的真菌菌株，根壤環(huán)境中篩選的產纖維素酶、據ITS序列特征，本研究鑒定的2個菌株，其ITS序列與數據庫中已知菌株的序列相似性均高于99.5，結合形態(tài)觀察的結果，最終確定菌株1為草酸青霉（Penicilliumoxalicum），菌株2為曲霉屬的Aspergilluspipe

20、ris。本實驗中菌株2纖維素酶的最適溫度是70，屬于嗜熱纖維素酶15，可應用于農業(yè),使纖維素降解為糖,再由糖轉化為乙醇,產嗜熱纖維素酶的工程菌可在高本實溫條件下大量生產酒精，為能源建設開辟新途徑。驗分離的兩菌株纖維素酶最適pH均為3.0，說明均具有較強的耐酸性，酸性纖維素酶可廣泛應用于釀酒、釀醋、果汁等食品工業(yè)中16。由于酸性木聚糖酶在pH4.0以下時仍然保持較高酶活性，可廣泛應用于飼料加工、釀酒工業(yè)、果汁加工等領域17。本研究所篩選的Penicilliumoxalicum和Aspergilluspiperis均具有較高的木聚糖酶酶活。今后將克隆進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分，提高酶活性。相關

21、的功能基因，深入研究其酶學性質，為開發(fā)新型纖維素酶和木聚糖酶制劑奠定基礎。參考文獻：1EveleighDE.Cellulase:aperspectiveJ.PhilTransRoyalSocLond同圖5可以看出，菌株1的纖維素酶的最適溫度是60，酶活為3.18IU；菌株2的纖維素酶活的最適溫度是70，酶活為1.22IU，盡管菌株2的纖維素酶活較低，但其具有一定的耐熱性，而且在3080范圍內酶活活性變化不明顯，說明溫度適用范圍較廣。2.5酶促反應最適pH的測定在不同的pH條件下測定菌株1和菌株2的木聚糖酶酶活，見圖6。圖6木聚糖酶的最適pHFig.6OptimumpHvalueofxylana

22、se由圖6可知，菌株1木聚糖酶的最適pH為5.0，但在pH4和pH6時仍分別保持85.6%和84.1%以上的酶活；菌株2木聚糖酶的最適pH為4.0，在pH48范圍內酶活變化不明顯，說明該木聚糖酶的pH適用范圍較廣，有兩菌的木聚利于酶在工業(yè)中的應用。但當pH大于9時，糖酶活明顯下降，在pH12時幾乎沒有酶活。不同pH條件下菌株1和菌株2的纖維素酶酶活見圖7。圖7顯示菌株1和菌株2纖維素酶的最適pH均為3.0。菌株1和菌株2在pH25范圍內纖維素酶酶活變化生物工程食品研究與開發(fā)FoodResearchAndDevelopment2011年9月第32卷第9期183酶法制備乳源抗菌肽的抗菌性研究陳婭嬌

23、（蒙牛（乳業(yè)）股份有限公司，內蒙古呼和浩特010000）摘要：研究了乳源抗菌肽的抗菌效果，研究表明乳源抗菌肽提取物對金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌皆有明顯的抗菌活性，但對金黃色葡萄球菌的抗菌活性強于乙型溶血性鏈球菌,酶法制備的乳源抗菌肽,有較好的抑菌效果。關鍵詞：乳源抗菌肽；酶解；抗菌EnzymaticPreparationofMilk-derivedAntimicrobialPeptideCHENYa-jiao（Mengniu（Dairy）Co.,Ltd.,huhhot010000，InnerMongolia，China）Abstract：ThearticlestudiedRuyuanan

24、tibacterialeffect，researchshowsRuyuanantibacterialpeptideextractsonStaphylococcusandhemolyticstreptococcalallbacteriahasobviousantibacterialactivityagainstStaphylococcusaureus，butthestrongantibacterialactivityinthebetahemolyticstreptococcus，ithasgoodantibacterialeffectsKeywords：milk-derivedantimicro

25、bial；hydrolysis；peptides隨著抗生素的廣泛應用，耐藥菌株逐年增多，目前金黃色葡萄球菌對青霉素G的耐藥菌株高達90%以上，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantStaphyrlococcusaureus，MRSA）已經成為醫(yī)院作者簡介：陳婭嬌（1986），女（漢），工程師，工程碩士，研究方向：食品加工工藝。內感染最常見的致病菌1-4。有些細菌甚至產生多重耐氯霉藥，如致病性大腸埃希菌約40%的菌株對鏈霉素、素、四環(huán)素等多種抗生素產生耐藥性；銅綠假單胞菌對許多抗生素具有天然或獲得耐藥性，這給臨床治療帶來極大的困難，如何有效防治細菌感染及控制細菌耐復雜、艱巨的任務，因藥性的產生與播散是一項長期、10徐威.微生物學實驗M.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2004:37-3811WhiteTJ,BrunsT.AnalysisofphytogeneticrelationshipsbyamplificationanddirectsequencingofribosomalRNAgenesM.NewYorkAcademicPress