切片標(biāo)本的制作

1、切片標(biāo)本的制作本次實驗采用的是石蠟切片法。石蠟切片法的程序如下：取材固定沖洗（洗滌）脫水透明包埋切片貼片烘片脫蠟復(fù)水染色脫水透明封藏。上述每個程序的要求和方法可歸納為透蠟制片和染色兩大步驟，現(xiàn)簡單介紹如下：脫水步驟為：將組織塊浸入系列酒精70%80%95%100%100%各30min。脫水的實際時間長短視組織塊的大小而定，但不宜過長。透明步驟為：將組織塊浸入二甲苯與無水乙醇（1：1）的混合液30min二甲苯30min二甲苯30min。透蠟步驟為：將組織塊浸入二甲苯與石蠟（1：1）的混合液30min石蠟30min石蠟30min。脫蠟程序為：純二甲苯（脫蠟）15min純二甲苯15min二甲苯：純乙

2、醇（1：1）3min復(fù)水程序為：純乙醇3min95%乙醇3min90%乙醇3min80%乙醇3min70%乙醇3min60%乙醇3min50%乙醇3min30%乙醇3min蒸餾水H、E染色程序為：將已復(fù)水的切片放入蘇木精染液中（30分鐘以上），水洗2分鐘，在05%的鹽酸水中分色3秒（當(dāng)在顯微鏡下檢查時，核褪至淡紅色，細(xì)胞質(zhì)及結(jié)締組織幾近無色即可）蒸餾水洗1分鐘，01%氨水中藍化（13分鐘，核呈藍紫色），蒸餾水洗（1分鐘），切片由低至高濃度的系列酒精中脫水（每級35分鐘）至95%乙醇切片入05%伊紅中復(fù)染（3分鐘）（伊紅由95%乙醇配制的）95%乙醇中分色（顯微鏡檢查呈藍紫色，胞質(zhì)及結(jié)締組織為粉

3、紅色）95%乙醇輕洗（除去玻片上多余的伊紅染液。動作要迅速，否則組織上的伊紅要脫下來）。透明程序為：將已脫水的切片依次放入純乙醇：二甲苯（1：1）二甲苯二甲苯中，每級15分鐘。1 21透蠟制片1211、取材 從實驗羅非魚最后一根背鰭下方用解剖刀取下3×3×4mm左右的新鮮肌肉塊取材時要注意組織塊方向與肌纖維走向要一致。同時，取材時動作迅速，保持組織的新鮮，取材所用的解剖刀要鋒利。1212、固定 把取下的肌肉組織塊迅速投入已預(yù)先配制好的Bouin,s固定劑中固定。固定劑中的藥品可以使構(gòu)成組織的蛋白質(zhì)變性凝結(jié)，組織塊硬化，從而保持組織及細(xì)胞的原來形態(tài)結(jié)構(gòu)。Bouin,s固定劑配

4、方如下：苦味酸飽和溶液 75ml 福爾馬林 25 ml 冰醋酸 5 ml 1213、沖洗（洗滌） 肌肉塊經(jīng)固定劑的處理，會在肌肉的表面或內(nèi)部殘留著組織液，這些殘留的藥品若不除去，將會對以后的制片過程產(chǎn)生不良影響，所以肌肉從固定劑中取出后，必須經(jīng)流水沖洗或數(shù)次的乙醇洗滌，使得組織中殘留的固定劑全部除去為止。1214、脫水 脫水的目的在于去除肌肉中的水分。在石蠟制片法中所用的滲透和包埋劑就是石蠟，由于石蠟和水是不相溶的。因此為了使石蠟?zāi)芎芎玫貪B透進肌肉組織的每個部分，就必須先把肌纖維細(xì)胞中的水分除去，在脫水時要用從低濃度到高濃度的系列酒精逐步脫水，這樣可避免肌纖維因脫水而過分地收縮。脫水需徹底。脫

5、水步驟為：將組織塊浸入系列酒精70%80%95%100%100%各30min。脫水的實際時間長短視組織塊的大小而定，但不宜過長。1215、透明 肌肉組織經(jīng)脫水后，石蠟也不能直接滲透進肌肉組織。此時還必須將肌肉塊中所含的乙醇除去，除去乙醇的藥品必須既能很好的與乙醇相溶，又能與石蠟相溶。經(jīng)這種藥品處理過的肌肉，使肌肉呈現(xiàn)透明狀，所以稱為透明劑。因此，這種處理程序就叫透明。這里采用的透明劑是二甲苯。當(dāng)肌肉組織中的乙醇被透明劑替代后，肌肉組織才能透蠟包埋。透明步驟為：將組織塊浸入二甲苯與無水乙醇（1：1）的混合液30min二甲苯30min二甲苯30min。1216、透蠟 透蠟是使包埋劑透入進肌肉組織的

6、各個部分的過程。透蠟是肌肉組織可在切片機上制作切片的需要。石蠟在常溫下呈固體狀，它是具有一定的熔點，透蠟時必須使石蠟熔化為液體狀態(tài)才能使石蠟滲入肌肉組織組織，所以透蠟過程必須在恒溫箱中進行。透蠟步驟為：將組織塊浸入二甲苯與石蠟（1：1）的混合液30min石蠟30min石蠟30min。1217、包埋 將完成透蠟程序的肌肉組織塊包埋在含有石蠟的小紙盒內(nèi)，便于保存及制作薄的石蠟切片。包埋時把熔化的石蠟倒入小容器內(nèi)，然后迅速夾取肌肉組織放入小容器中，并適當(dāng)調(diào)整肌肉組織塊的位置和方向，待容器中的石蠟迅速凝成蠟塊。1218、切片 肌肉組織塊經(jīng)上述各程序的處理后，不僅變得較硬，而且有了石蠟的支撐，經(jīng)修整后便

7、可以放在切片機上切成極薄的石蠟切片。切片的厚度為8um。1219、貼片 把由切片機上切下的含有肌肉組織的蠟條割成小段，再將小段蠟條安放在均勻涂過蛋白質(zhì)的載玻片上，滴上蒸餾水使其在展片臺上加熱，在加熱過程中使蠟條適當(dāng)?shù)厣煺归_，以此使組織伸展平正，然后把玻片上多余的水分去掉。12110、烘片 把貼好蠟片的載玻片置于37的恒溫箱中烘烤24小時以上，使切片干燥。122 染色以下各步驟均需在染色缸中進行，所以需預(yù)先準(zhǔn)備好一套清潔的染色缸，分別貼上系列標(biāo)簽并加入相應(yīng)的藥品。1221、脫蠟 通過切片、貼片及烘片后，肌肉組織仍埋藏在蠟中，為了使肌肉組織順利染上色，必須先將肌肉組織切片上的蠟去掉，因此要把貼片烘

8、干后的的玻片放入含有二甲苯的染色缸內(nèi)，使蠟溶解在二甲苯中。脫蠟程序為：純二甲苯（脫蠟）15min純二甲苯15min二甲苯：純乙醇（1：1）3min1222、復(fù)水 在肌肉組織透蠟包埋前已把肌肉組織中的水去除干凈了，而沒有經(jīng)過復(fù)水處理的肌肉組織切片不能放入水溶性的染料中染色，所以染色前肌肉組織切片中必須經(jīng)復(fù)水處理，也就是使得肌肉組織中含有水分。肌肉組織切片復(fù)水過程必須逐漸進行，即從純乙醇經(jīng)下降的各濃度系列酒精直至水，每級35分鐘。在水中的放置時間要稍加長，大約10分鐘以上，蘇木精染液才能上色。復(fù)水程序為：純乙醇3min95%乙醇3min90%乙醇3min80%乙醇3min70%乙醇3min60%乙

9、醇3min50%乙醇3min30%乙醇3min蒸餾水1223、染色 組織或細(xì)胞的許多結(jié)構(gòu)在自然狀態(tài)下是無色或具有很淡的顏色的，要區(qū)分出組織和細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)是極為困難的，為了更好地對組織的各種結(jié)構(gòu)進行觀察，必須染色。染色時將切片放入預(yù)先制好的染色劑內(nèi)，根據(jù)不同的目的、不同的染色劑的要求染色一定時間后取出切片，切片再行水洗、分色或復(fù)染等程序的處理。本實驗的染色采用蘇木精（hematoxylin）、伊紅（eosin）染色法，簡稱為H、E染色法。蘇木精是一種堿性染料，組織或細(xì)胞中由酸性物質(zhì)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核中的核酸等可被它染成藍紫色。組織或細(xì)胞中可被堿性染料著色的結(jié)構(gòu)或成分稱為嗜堿性。根據(jù)配制方法的

10、不同，蘇木精可配成多種蘇木精染料。伊紅是一種酸性染料，細(xì)胞中由堿性物質(zhì)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)可被染成紅色或粉紅色（如細(xì)胞質(zhì)），這種結(jié)構(gòu)或成分稱為嗜酸性物質(zhì)。H、E染色程序為：將已復(fù)水的切片放入蘇木精染液中（30分鐘以上），水洗2分鐘，在05%的鹽酸水中分色3秒（當(dāng)在顯微鏡下檢查時，核褪至淡紅色，細(xì)胞質(zhì)及結(jié)締組織幾近無色即可）蒸餾水洗1分鐘，01%氨水中藍化（13分鐘，核呈藍紫色），蒸餾水洗（1分鐘），切片由低至高濃度的系列酒精中脫水（每級35分鐘）至95%乙醇切片入05%伊紅中復(fù)染（3分鐘）（伊紅由95%乙醇配制的）95%乙醇中分色（顯微鏡檢查呈藍紫色，胞質(zhì)及結(jié)締組織為粉紅色）95%乙醇輕洗（除去玻片上多余的伊紅染液。動作要迅速，否則組織上的伊紅要脫下來）。1224、脫水 為了長久保存切片，已染色的切片必須脫水才能封藏。所以切片再入純乙醇中脫水兩次。脫水程序為：純乙醇純乙醇1225、透明 為了更有利于對組織和細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行觀察分析，還