復(fù)方丹參注射液對(duì)受損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(一)

1、復(fù)方丹參注射液對(duì)受損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(一)    作者：任香善，宋京郁，李柱虎，林貞花，金賢國【關(guān)鍵詞】 復(fù)方丹參注射液；,血管內(nèi)皮；,掃描電鏡摘要：目的探討復(fù)方丹參注射液對(duì)氧化所致?lián)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。方法采用臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein cells)，用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell, EC）的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。分光光度計(jì)測定細(xì)胞上清液中丙二醛的含量。結(jié)果掃描電鏡觀察顯示過氧化氫組EC皺縮變小，細(xì)胞表面干裂，表面微絨毛減少甚至消失，細(xì)胞間隙增寬，而經(jīng)丹參預(yù)處理

2、過的過氧化氫組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)則明顯改善。MDA含量測定表明過氧化氫組的MDA含量明顯增高。相反，正常組和丹參組中MDA含量減少（P0.01）。結(jié)論 復(fù)方丹參注射液通過其抗氧化作用，對(duì)氧化所引起的受損血管EC有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：復(fù)方丹參注射液； 血管內(nèi)皮； 掃描電鏡Effects of the Compound Injection of Danshen on the Morphological Structure of Injured Vascular Endothelial CellsAbstract：ObjectiveTo study the protective effects of the

3、 compound injection of Dan-shen on cultured endothelial cells (EC) injured by oxidization. MethodsThe morphological characteristics of EC in primary cutured human umbilical vein cells (HUVEC) in vitro were ovserved by the inverted microscope and scanning electron microscopy(SEM). The content of MDA

4、in the supernatant fluid of cultured EC cells was detected by spectrophotometry.ResultsIt was observed by SEM that ECs in the H2O2 group were wrinkle and small, cell membrane had split and aperture, the microvillus decreased or disappeared, stiff or broken, and the cell gaps were wide. However, ECs

5、in the Danshen group was similar with the normal group. MDA content obviously increased in the H2O2 group. However, the content of normal and Danshen group decreased. (P0.01) .ConclusionThe compound injection of Danshen has protective effects on the injured vascular endothelial cells induced by oxid

6、ization through antioxidization function, Key words：Injection, Dan-shen; Vascular endothelial cell; Scanning electron microsopy 心血管疾病是人類死亡的首要原因。在各種心腦血管疾病中，很多都是由動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS）而引起。而許多研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell, EC）損傷是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)1。因此保護(hù)血管內(nèi)皮對(duì)防治AS具有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)通過掃描電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，用分光光度法檢測MDA含量,以探討丹參對(duì)

7、受損傷的血管EC的保護(hù)作用，以及其抗AS的作用機(jī)理。1 材料與方法1.1 藥物與試劑復(fù)方丹參注射液（含丹參1 g/ml）為上海中西藥液股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)021001；M199培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國HYCOLONE公司產(chǎn)品；MDA試劑盒為北京邦定公司提供；掃描電鏡為日本產(chǎn)品。1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)按Jaffe等2,3人的方法略加修改進(jìn)行。在無菌條件下，取健康產(chǎn)婦的臍帶， 灌注0.1%型膠原酶（collagenase-）10 15 ml，置37水浴中孵育1520 min。1 000 r/min離心10 min，沉淀中加入含有20FBS的完全M199培養(yǎng)液5 ml，

8、充分混合制成細(xì)胞懸液，以（1.52.0）×104/cm2密度植入培養(yǎng)瓶中，置37，5的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液，待細(xì)胞長成融合狀態(tài)后進(jìn)行鑒定及進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組：正常組：加入含20FBS的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；H2O2組：首先加入含20 FBS的完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞基本融合時(shí)再加入終濃度為75 mol/L的H2O2刺激4 h；丹參組：加入含20 FBS的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，再加入終濃度分別為0.125，0.25 ，1.25 ， 2.5 mg/ml 和12.5 mg/ml的復(fù)方丹參注射液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再加入終濃度為75mol/L的H2O2刺激4

9、 h。1.4 用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞生長情況選用生長良好的HUVEC，制成細(xì)胞懸液接種于預(yù)置蓋玻片的24孔板中，每孔加入（12）×105個(gè)HUVEC，放置于37，5的 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，含20FBS的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長呈亞融合狀態(tài)后 各組按上述方法處理。取出玻片，放入3戊二醛固定1 h，PBS洗3次，1鋨酸固定，PBS洗3次，梯度酒精脫水，用CO2臨界點(diǎn)儀進(jìn)行干燥，用離子濺射儀噴金，日立S3500N掃描電鏡觀察。1.5 丙二醛（MDA）含量測定選用生長良好的HUVEC，制成細(xì)胞懸液，以濃度（12）×105/ml接種于24孔培養(yǎng)板。每組8個(gè)孔，設(shè)置7個(gè)

10、組。細(xì)胞處理同上，終止培養(yǎng)并分別收集所有孔的上清液1 ml，置于20冰箱待測，然后按照北京邦定生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒說明，用分光光度計(jì)檢測MDA含量。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)值均以±s表示,組間比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 結(jié)果2.1 內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在倒置相差顯微鏡下觀察，正常組EC生長旺盛，呈上皮樣貼壁生長，細(xì)胞呈多角形或長梭形，呈鵝卵石樣鋪滿底層。在75 mol/L的 H2O2作用4 h后，細(xì)胞間隙增大，胞體變小，細(xì)胞收縮變圓，失去細(xì)胞間連接，胞漿透明，少數(shù)細(xì)胞懸浮脫落；隨著作用時(shí)間進(jìn)一步延長，胞膜邊緣不清楚，部分胞膜不完

11、整，細(xì)胞出現(xiàn)空泡和顆粒變性，細(xì)胞脫落增多，到將近4 h的時(shí)候出現(xiàn)拉網(wǎng)現(xiàn)象。而經(jīng)丹參預(yù)處理過的H2O2組EC形態(tài)與正常組相似，并且濃度越高越接近正常細(xì)胞組。掃描電鏡可以觀察到正常組(圖1)EC呈圓形或梭形、多角形，表面微絨毛豐富，排列規(guī)則，有光澤，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞間隙較小，細(xì)胞連接可見。H2O2組(圖2)的EC皺縮變小，細(xì)胞表面干裂，胞膜表面有孔隙，有的呈現(xiàn)不規(guī)則鋸齒狀，表面微絨毛減少甚至消失，細(xì)胞間隙增大，微絨毛僵直斷裂，分布不規(guī)則，減少甚至消失，可見微絨毛水腫。而丹參組(圖3)的EC形態(tài)結(jié)構(gòu)則明顯改善，其形態(tài)、大小及微絨毛數(shù)量、分布與正常組相似。圖1 正常組EC（Bar=15m）(略) 圖2

12、 H2O2組EC（Bar=6m）(略) 圖3 丹參組EC(Bar=30m)(略)2.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA的檢測結(jié)果用H2O2 刺激細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA含量明顯升高，而用復(fù)方丹參預(yù)處理的細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA含量與正常組相似。H2O2組與正常組和丹參組比較具有顯著性差異（P0.01）。結(jié)果見表1。表1 各組內(nèi)皮細(xì)胞中丙二醛含量的比較(略)與H2O2組作比較，*P 0.01，n=8 3 討論動(dòng)脈粥樣硬化是引起各種心血管疾病的主要原因。引起動(dòng)脈粥樣硬化的因素很多，其中“炎癥-反應(yīng)”學(xué)說4是最受人們關(guān)注的。 研究表明5體內(nèi)許多因素可損傷VEC，以活性氧最重要。活性氧除能使VEC膜脂質(zhì)、蛋白

13、質(zhì)、核酸等氧化破壞外，并可氧化修飾低密度脂蛋白，進(jìn)而更加促進(jìn)AS的發(fā)展。文獻(xiàn)中提出6H2O2是活性氧，可促進(jìn)自由基生成。生物體內(nèi)過氧化氫如不及時(shí)被過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶消除，它可通過細(xì)胞膜，在膜外與Fe2或Cu2生成羥自由基OHo，從而引發(fā)脂類過氧化而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)的掃描電鏡觀察結(jié)果顯示H2O2組內(nèi)皮細(xì)胞明顯受損，細(xì)胞明顯腫脹及微絨毛消失等超微結(jié)構(gòu)上的變化。而丹參組 的內(nèi)皮細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)上無明顯變化，與正常組相似。表明丹參對(duì)受損傷VEC具有保護(hù)作用。生化學(xué)檢測MDA含量常常反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。脂質(zhì)過氧化作用不僅把活性氧轉(zhuǎn)化成活性化學(xué)劑，而通過鏈

14、式或鏈?zhǔn)街ф湻磻?yīng)，放大活性氧的作用。因此初始的一個(gè)活性氧能導(dǎo)致很多脂類分解產(chǎn)物的形成，這些分解產(chǎn)物中的一些能引起細(xì)胞代謝及功能障礙，甚至死亡。中醫(yī)理論認(rèn)為，丹參具有活血化淤、調(diào)經(jīng)止痛、養(yǎng)血安神、涼血消腫等功能，而且有關(guān)丹參的抗氧化作用已經(jīng)得到人們的重視。徐東坡等7人研究結(jié)果表明，丹參對(duì)氧自由基清除酶SOD的保護(hù)作用優(yōu)于亞硝酸鈉。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與許晶蘭等8人做的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2O2使VECs的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加，而預(yù)先加入丹參可減輕VECs的氧化損傷, 細(xì)胞損傷不明顯。丹參可能通過清除氧自由基的作用穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而減輕H2O2的氧化損傷作用?？傊?本研究結(jié)果表明復(fù)方丹參注射液具有

15、保護(hù)由過氧化氫所致?lián)p傷的血管EC的作用，從而起到抗AS的目的，其機(jī)理可能與丹參抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。參考文獻(xiàn)：1 Ross.The pathogenesis of atherosclerosis-anupclateJ.N Eng J Med, Feb 20 1986,314:488.2 Basavaraju SR,Jones TD.Atherosclerosis risks from chemicals:part 1.toxicological observations and mechanisms of atherosclerosisJ.Arch Environ Contam Toxicol, 1998,35：152.3 何作云.提高冠心病的防治水平，重視血管內(nèi)皮功能損傷的研究J.中國血液流變學(xué)雜志，2002，12（3）：161.4 Ross R, Atherosclerosis -an inflammatory diseaseJ. N Engl J med. 1999, 340 (2):