多次移植骨髓基質(zhì)干細胞有利于脊髓損傷修復(fù)

1、多次移植骨髓基質(zhì)干細胞有利于脊髓損傷修復(fù)作者：李輝映文益民 陳克明藍旭汪大彬?qū)O振剛胡凌云 作者單位：1.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院, 蘭州 730018；2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 a.脊柱外科;b.骨科研究所, 蘭州 730050；基金項目：全軍醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究"十一五"計劃課題項目（編號：06MA081） 【摘要】 目的研究多次經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植骨髓基質(zhì)干細胞對Wistar大鼠脊髓損傷的功能修復(fù)作用。方法骨髓基質(zhì)干細胞經(jīng)體外分離、培養(yǎng)并用Hoecst33342標記。按照Allen方法把60只在T10-T12平面損傷的Wistar大鼠隨機分4組，A、B、C、D組（對照組）。在損傷平

2、面蛛網(wǎng)膜下腔中段放置一硅膠管，在7 d后，注入1×106個骨髓基質(zhì)干細胞。在2、3、5、7、12周熒光顯微鏡、免疫組化檢測骨髓基質(zhì)干細胞在損傷段脊髓的存活、分布、分化情況并作計數(shù)觀察。使用BBB評分觀測后肢功能恢復(fù)。結(jié)果移植后714 d骨髓基質(zhì)干細胞達到高峰，在7 d后表達巢蛋白及神經(jīng)絲蛋白陽性。隨時間的延長，移植在損傷部位的骨髓基質(zhì)干細胞數(shù)量及神經(jīng)元樣細胞均有減少，但移植3次的細胞數(shù)減少速度較其他兩組慢。移植3次組大鼠的BBB評分較移植1、2次組有明顯的提高，P0.01,有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論多次移植骨髓基質(zhì)干細胞更有利于脊髓損傷的恢復(fù)。 【關(guān)鍵詞】 脊髓損傷骨髓間充質(zhì)干細胞 移植蛛網(wǎng)

3、膜下腔 Repeated transplantation of bone marrow stromal cells into subarachnoid space to promote spinal cord injury repair LI Huiying,WEN Yimin,CHEN Keming,et al. The Second Clinic Hospital,Lanzhou University, Gansu 730018，China Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of multiple subarachnoid infusi

4、on of bone marrow stromal cells(BMSCs) on spinal cord injury repair in adult Wistar rats.MethodThe BMSCs were cultured, purified and labeled with Hoecst33342 in vitro. After the complete spinal cord injury rat model at T10T11 level was successfully established, sixty injured rats were randomly divid

5、ed into 4 groups: groups A, B, C, and D. The labeled BMSCs in a dose of 1×106 /0.2 ml were injected into subarachnoid space of the rats via a catheters under the aubarachnoid space in group A,B and C. The cells were administered only once in group A 1week after injury. However, they were inject

6、ed after injury 1 and 3 weeks in group B and 1, 3 and 5 weeks after injury in group C, respectively. Neurological functions were evaluated using the BassoBeattieBresnahan (BBB) Scale 1, 3，7，9 and 12 weeks after transplantation. The immunohistochemistry and fluorescence microscopy were analyzed to ob

7、serve the migration, survival, differentiation and histomorphology of BMSCs. ResultThe transplanted BMSCs survived and grew in the injured region and the nearby spinal cord. Some of them expressed preneuronal marker nestine, and others expressed neuronal marker neurofilament200 (NF200) 1 or 2 weeks

8、after transplantation. As time went on, the planted cells gradually decreased. There was a significant improvement in the BBB scores and neurological functions of rats treated with BMSCs compared to those of rats in the control group (P<0.05). Furthermore, the three BMSCtreated groups achieved mo

9、re functional recovery than the other BMSCtreated and control groups.ConclusionThe study showed that multiple transplantations of BMSCs into subarachnoid space are beneficial, to some extend, to the repair of SCI. So this way may be a helpful method in restoring neurological function. Key words：spin

10、al cord injury; bone marrow stromal cell; transplantation; subarachnoid space 脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷, 對其治療一直是研究的難點。近年來組織工程研究發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細胞( bone marrow stromal cells,BMSCs) 移植具有修復(fù)SCI的作用。為了探討B(tài)MSCs移植的有效治療方案,使BMSCs 移植成為臨床上治療SCI的有效方法, 本實驗通過蛛網(wǎng)膜下腔置管多次移植BMSCs于脊髓損傷的 Wistar大鼠蛛網(wǎng)膜下腔上, 報告如下。 1

11、 材料與方法 1.1 主要試劑及儀器 DMEMF12培養(yǎng)基、Hoecst33342、胰蛋白酶(Gibco公司,美國)；胎牛血清FBS (四季青公司)；Nestin抗體、NF抗體、SABC試劑盒(博士德生物工程有限公司)。主要儀器: 倒置相差顯微鏡(OLYMPUSIX70,日本), CO2 孵育箱(HERA 美國)， 熒光顯微鏡(OLYMPUSIBX51，日本)。 1.2 動物模型制造 健康雌性不限的Wistar大鼠,體重(220 ±20) g,60只。用戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉,俯臥固定,切口以T11為中心,顯露脊髓3 cm×0.4 cm的打擊區(qū)。其上置一2 m

12、m2的打擊墊, 用改良的Allen打擊器，能量高度為9 g×10 cm。打擊后可見大鼠雙后肢抽動、甩尾,隨后完全松弛。打擊后在直視下距離打擊1.5 cm的損傷下端硬脊膜處用一尖針刺破硬脊膜，用一直徑0.1 mm的硅膠管，內(nèi)放置一導(dǎo)絲，緊貼硬脊膜、蛛網(wǎng)膜，緩慢置于損傷中上段，退導(dǎo)絲可見有淡血性的腦脊液從管內(nèi)流動，視為成功，嚴密固定，管口火封，埋于皮下, 術(shù)后每日膀胱擠尿3次，共計2周，動物分籠清潔飼養(yǎng)。 1.3 BMSCs的培養(yǎng) 將120 g左右Wistar大鼠處死,無菌條件下取中段股骨, 用含肝素的無血清DMEM培養(yǎng)基混合液沖出骨髓腔中的骨髓至無菌平皿中。300目濾網(wǎng)過濾制成單個細胞

13、。置37、5%CO2 孵育箱中培養(yǎng)。接種2 d后可見細胞貼壁換液。待細胞長滿瓶底的80% 90%時傳代。傳至第2代后, 在移植前30 min加入Hoecst33342 10 ug/ml孵育箱中30 min，標記BMSCs。移植時, 制成濃度約為1×107/ml細胞懸液0.1 ml移植。 1.4 細胞移植 造模后第7 d進行細胞移植。脊髓損傷后第7 d BBB評分4為納入標準，共60只。隨機分為四組：A 、B、C組（分別為第1周移植1次；第1、3周移植2次；第1、3、5周移植3次組），D組（對照組）。手術(shù)時剪開管口，將準備好的細胞懸液0.1 ml緩慢注入，約5 min，使用0.1 ml

14、 PBS液沖管道。對照組注入0.2 ml PBS。 1.5 神經(jīng)功能評價 采用Basso 等1提出的大鼠SCI后功能評判標準(BBB 評分法), 總分21分。 由2名熟悉BBB評分標準的非實驗人員觀察。 將動物置于直徑1 m的平面光滑場地自由活動5 min, 記錄動物后肢運動情況。 1.6 動物標本制備 分別在2、3、5、7、12周處死動物。大鼠麻醉，左心室穿刺至主動脈，先灌注肝素化的生理鹽水60 mL，再用4%多聚甲醛液進行灌注約30 min。將損傷段及損傷上下段各約0.5 cm的脊髓用4%多聚甲醛液固定24 h。 1.7 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)方法采用SABC法，其程序按常規(guī)方法進

15、行。檢測神經(jīng)干細胞前體細胞的標記物巢蛋白（Nestine）及神經(jīng)細胞的標記物神經(jīng)絲蛋白（NF200）。 1.8 移植細胞計數(shù) 每個標本取損傷中心及頭尾兩端3張切片, 由2名非本課題組并且熟悉BMSCs形態(tài)的實驗人員在200倍熒光鏡下隨機選擇6個不重疊視野觀察、照相計數(shù)，收集數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。 1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0 軟件包, 所得數(shù)據(jù)以±s表示,進行組間多個樣本均數(shù)的多重比較的單因素方差分析。P<0.05表示有差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。 2 結(jié) 果 2.1 實驗動物數(shù)量分析 各組實驗動物均全部進入結(jié)果分析,術(shù)后創(chuàng)傷過重死亡7只,膀胱破裂死亡2只，均予補足。

16、 2.2 BMSCs的體外培養(yǎng)與鑒定 從新鮮骨髓中分離獲取的單個核細胞培養(yǎng)12 h后逐漸出現(xiàn)貼壁細胞, 其他血細胞通過換液逐漸棄去, 812 d 細胞90%以上融合,可傳代。傳至第2代后移植，此時貼壁細胞的特點是呈成纖維細胞樣, 形態(tài)不一,梭形、多角形或星芒狀突起。 2.3 神經(jīng)功能評價 各組大鼠在1、3、5 、7、9、12周時進行BBB 評分。脊髓損傷后1周, 移植組與對照組動物的BBB 評分沒有差異(P>0.05)。移植后，隨時間的延長，BBB評分均有增加，功能有恢復(fù)。在術(shù)后3周，移植組均移植1次，BBB評分增加至56分。D組與其他三組比較，P<0.01, 有統(tǒng)計學(xué)意義。12周

17、后比較，移植3次BBB評分為17.31±0.59,較移植2次評分高4分，較移植1次組評分高7分，與其他3組比較，后肢功能改善明顯，BBB評分增加，P<0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。 2.4 熒光顯微鏡觀察BMSCs結(jié)果 Hoecst33342標記的BMSCs細胞核呈藍色，移植細胞大量聚集于損傷區(qū)，714 d達到高峰。移植7周后，移植3次組較移植1、2次組BMSCs數(shù)量明顯增多，P<0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義。后隨時間的增加，移植的細胞逐漸減少（圖2、3）。移植12周后，移植3次組在損傷區(qū)的剩余BMSCs數(shù)量較其他兩組明顯多，有統(tǒng)計學(xué)意義。P<0.01，另外2、3次移植

18、后細胞數(shù)并沒有呈倍數(shù)增長，維持在一定的水平。 2.5 NF200、Nestin免疫組化結(jié)果 移植BMSCs后，NF在1周后表達陽性，以損傷區(qū)周圍最多，2周達到高峰，以后會逐漸減少，尤以損傷區(qū)周圍減少明顯。移植3次組神經(jīng)元樣細胞減少的速度較其他兩組慢，3個月后仍有較多的NF陽性細胞（圖4）。移植3次組可見有大量的神經(jīng)絲穿過損傷區(qū)，明顯較移植1、2次組多，對照組很少有神經(jīng)絲穿過損傷區(qū)。移植的BMSCs在1周后可以轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞前體細胞的標記物Nestin陽性，主要在損傷區(qū)周圍，2周后Nestin陽性細胞會減少，3周后未見到Nestin陽性細胞。 3 討 論 BMSCs具有自我更新和多向分化增殖潛

19、能，移植對脊髓損傷的治療作用在不同的實驗研究中已得到了證實，但其作用機制仍在研究中。Harvey等2認為BMSCs的營養(yǎng)支持及替代作用在治療中起了重要作用。遷移至病變部位的BMSCs同損傷宿主神經(jīng)組織間能夠產(chǎn)生數(shù)種神經(jīng)營養(yǎng)因子,如神經(jīng)生長因子（NGF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子3（NT3）、腦源生長因子（BDNF）等。這些因子可減輕脊髓損傷的炎性反應(yīng)和保護損傷的神經(jīng)細胞，減少細胞的凋亡并促進軸突再生3,4。實驗發(fā)現(xiàn)這些營養(yǎng)因子半衰期短，幾分鐘到幾小時不等，如BDNF、NGF隨著分化，含量是逐漸降低的5,6；錨靠在脊髓損傷處的BMSCs及分化的神經(jīng)元樣細胞隨時間的增加會減少7。這些因素提示移植BMSCs治療

20、SCI,必須考慮它的存活與凋亡，即移植的有效性。受以上因素的啟發(fā)，反復(fù)間斷多次移植早期有活力BMSCs，更利于功能恢復(fù)。這樣的研究目前還未見報道。 本實驗用Hoecst33342標記的BMSCs經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔直接移植損傷區(qū)，發(fā)現(xiàn)移植12周后存活的細胞達到最高峰，移植的細胞并沒有全部到達損傷區(qū)。隨著時間的延長，移植的細胞與分化的神經(jīng)元樣細胞數(shù)是減少的。與Yano等79認為移植在SCI大鼠體內(nèi)的細胞及分化的神經(jīng)元樣細胞隨時間增加，會逐漸減少的實驗結(jié)果相符。提示脊髓損傷區(qū)并非是移植的BMSCs及分化的神經(jīng)元樣細胞的理想的生存環(huán)境，可能與缺乏營養(yǎng)基質(zhì)致一些移植細胞及分化的細胞凋亡有關(guān)9。多次移植后，遷移

21、于損傷區(qū)并存活的細胞并沒有呈倍數(shù)增長，而維持在一定的水平，可見脊髓損傷后移植細胞的遷移有一定的量的限制，即有飽和性，這與SCI的內(nèi)環(huán)境所產(chǎn)生的趨化因子的量的變化有一定的關(guān)系10，趨化因子的量決定了遷移的BMSCs的數(shù)量，但隨時間的延長，BMSCs數(shù)量減少速度較移植一次慢，相對應(yīng)在功能恢復(fù)上明顯提高。其原因是不斷的補充有活力的BMSCs，保證了BMSCs在脊髓損傷部位的數(shù)量，分泌的營養(yǎng)因子，如BDNF、NGF等保持較高水平，加速了損傷軸突的再生長或有助于神經(jīng)元樣細胞的存活11。或轉(zhuǎn)化為更多的神經(jīng)元樣細胞后，發(fā)出神經(jīng)絲，穿過損傷處，更有助于神經(jīng)通路的修復(fù)貫通12。胥少汀等13認為修復(fù)損傷脊髓的關(guān)鍵

22、是提供軸突生長的通道，只有提供了軸突生長的通道，才能希望修復(fù)損傷脊髓，在運動功能恢復(fù)上取得進展。移植3次BMSCs的數(shù)量是移植1次的3倍，聚集于損傷區(qū)的細胞存活時間也長。免疫組化觀察到移植3次的神經(jīng)絲穿過斷端的密度高于移植2次及1次，對照組很少有神經(jīng)絲穿過斷端；功能恢復(fù)上也強于移植2次，移植2次強于1次，其細胞凋亡也逐漸減少。說明移植BMSCs治療SCI功能的恢復(fù)，與存在損傷區(qū)一定BMSCs的量、存在的時間長短有一定的關(guān)系。與Mahmood 等14研究認為移植BMSCs治療腦外傷癱瘓的功能恢復(fù)與移植細胞數(shù)的量有一定的關(guān)系結(jié)果相似。多次移植后對SCI的功能恢復(fù)產(chǎn)生一個良性循環(huán)的結(jié)果。 移植BMS

23、Cs治療脊髓損傷，功能的恢復(fù)與存在于損傷區(qū)一定BMSCs的數(shù)量、存在的時間長短有一定的關(guān)系。多次移植可在損傷局部提供足夠數(shù)量有活力的BMSCs，可彌補BMSCs使用率不高的缺點，從細胞量上不斷補充修復(fù)脊髓的需要，也避免了局部移植再次損傷的缺點，還可分泌各種營養(yǎng)因子或轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞促進軸突生長，更有利于SCI的修復(fù)。這也為BMSCs移植應(yīng)用于臨床提供一種新的思路。但是這種方法如果應(yīng)用于臨床，在移植時間間隔、細胞量上有待于進一步研究。 【參考文獻】 1Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. A sensitive and reliable locomotor r

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