產(chǎn)蛋白酶毛霉的分離篩選及發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的初步研究

1、現(xiàn)代食品科技Modern Food Science and Technology 2010, Vol.26, No.9產(chǎn)蛋白酶毛霉的分離篩選及發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的初步研究龐宗文，李敏，李樹波，梁靜娟（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005）摘要：采用脫脂乳平板透明圈法和麩皮培養(yǎng)基發(fā)酵測定法篩選到一株產(chǎn)蛋白酶活力較強(qiáng)的毛霉菌株HN201。以蛋白酶活力、游離氨基含量、活性肽活性為指標(biāo)，對篩選得到的HN201菌株固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)蛋白酶及大豆肽的最優(yōu)條件進(jìn)行研究。研究表明，28 發(fā)酵培養(yǎng)96 h時總蛋白酶活力最高；游離氨基含量隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，培養(yǎng)120 h時達(dá)到77 mmol/L，是

2、發(fā)酵前的17倍；培養(yǎng)96 h時產(chǎn)生的大豆肽具有最高還原能力，是相同濃度Vc還原能力的85%左右，是發(fā)酵前的1.8倍；培養(yǎng)48 h時產(chǎn)生的大豆肽清除DPPH的能力最高，約是相同濃度Vc清除能力的60%，是發(fā)酵前的3.5倍；清除超氧陰離子自由基的能力隨培養(yǎng)時間和溫度的變化很小，發(fā)酵后無明顯提高。SDS-PAGE電泳分析可知，豆粕發(fā)酵所產(chǎn)大豆肽分子量主要集中在10 kD以下。關(guān)鍵詞：毛霉；豆粕發(fā)酵；大豆肽 文章篇號：1673-9078(2010)9-956-961Screening of a Protease-producing Mucor Strain for Soybean PeptidesPr

3、oduction with Fermented Soybean MealPANG Zong-wen, LI min, LI Shu-bo, LIANG Jing-juan(College of Life Science and Technology of Guangxi University, Nanning 530005, China)Abstract: A new strain of Mucor, HN201, was screened using the method of clear zone resulting from hydrolysis of casein in plate a

4、nd fermentation in wheat bran medium, which produced high activity of protease. The optimal conditions for solid-state fermentation of soybean meal byHN201 to were studied based on the protease activity, free amino content and antioxidant capability of the soybean peptide. The highest protease activ

5、ity was achieved when fermentation temperature and time were 28 and 96 h, respectively. Free amino acid content of the fermented mixture increased to 77 mmol/L by prolonging the fermentation time to 120 h, which was 17 times higher than that of the unfermented soybean. The highest reducing capabilit

6、y and 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH)-scavenging capability of soybean peptides were observed at 96 h and 48 h, respectively, which were 3.5 and 1.8 times respectively higher than those of the unfermented soybean meal. Comparative study showed that its reducing capability and DPPH-scaveng

7、ing capability were 85% and 60% of Vc with same concentration. And little changes in its scavenging ability on superoxide anion radical were found after fermentation. Electrophoresis analysis showed that the molecular weight of soybean peptide were lower than 10 kD.Key words: Mucor strains; soybean

8、fermentation; soybean peptides蛋白酶廣泛存在于微生物中。微生物產(chǎn)生的蛋白酶一般均為胞外酶1，與動植物來源的蛋白酶相比，其下游技術(shù)處理相對簡單，成本較低。也由于微生物易于培養(yǎng)，生長周期短，因此微生物來源的蛋白酶易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。在我國，毛霉長期應(yīng)用于豆腐乳等發(fā)酵豆制品中，合成及分泌多種胞外蛋白酶的能力強(qiáng)，而且毛霉的胞外蛋白酶系對于大豆蛋白具有很收稿日期：2010-05-05作者簡介：龐宗文（1964-），男，副教授，研究方向：微生物酶學(xué)、生物化工高的水解效率2。與黑曲霉和米曲霉蛋白酶相比，毛霉蛋白酶水解蛋白的產(chǎn)物沒有苦味，適口性好，因此在大豆蛋白肽的生產(chǎn)中有很大

9、的潛力。豆粕是大豆榨油后的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%以上，一般作為飼料來處理。對豆粕的微生物發(fā)酵處理，主要是提高豆粕蛋白的溶解度，有效地降解其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子和大分子蛋白質(zhì)，使豆粕更容易消化吸收。而且發(fā)酵豆粕具有一定的芳香氣味和鮮味，適口性好。大豆肽具有抗氧化、抗疲勞、降血壓和降血脂等956現(xiàn)代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010, Vol.26, No.9多種生理功能，是一種非常有前途的功能性食品原料和肽類藥物原料3。目前大豆肽大多采用條件溫和、安全性高的酶水解法進(jìn)行生產(chǎn)。但酶法生產(chǎn)大豆肽存在著酶價格昂貴，產(chǎn)物得率不高的缺陷，而且由于大豆

10、蛋白經(jīng)酶水解后其疏水性氨基酸殘基會暴露出來，限制了其在得到的大豆肽往往帶有較明顯的苦味45，食品中的應(yīng)用。而利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)大豆肽，不僅解決了苦味問題，而且大大降低了生產(chǎn)成本。用微生物生產(chǎn)工業(yè)用大豆蛋白酶和用豆粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)大豆肽鮮見報道，本研究將篩選得到的產(chǎn)蛋白酶活力較強(qiáng)的毛霉菌株應(yīng)用于豆粕的固態(tài)發(fā)酵中，對豆粕發(fā)酵水提物中的酶活力、游離氨基含量、大豆肽活性的最優(yōu)條件進(jìn)行了初步研究，以期為毛霉蛋白酶在固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)大豆多肽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 1 材料與方法1.1 材料1.1.1 樣品采集土樣采自廣西南寧、欽州、防城港、桂林及海南等地，共55份。選擇植被厚、枯枝落葉多、有機(jī)質(zhì)豐富且

11、陰暗潮濕的土壤采集。 1.1.2 培養(yǎng)基（1）PDA培養(yǎng)基（%）：土豆 20，葡萄糖 2，瓊脂 1.2，pH 6.0。（2）查氏培養(yǎng)基（%）：蛋白胨 0.5，葡萄糖 1，KH2PO4 0.1，MgSO4 0.05，瓊脂 2，pH 6.0。（3）脫脂乳平板培養(yǎng)基（%）：脫脂乳 1.5，瓊脂 2，pH 6.0。 （4）麩皮培養(yǎng)基：麩皮 9 g，豆粕 1 g，硫酸銨 0.05 g，水10 mL，pH 6.0。 （5）豆粕培養(yǎng)基：豆粕 9 g，麩皮 1 g，水10 mL，pH 6.0。 1.2 方法1.2.1 產(chǎn)蛋白酶毛霉菌株的分離篩選（1）分離 取土樣5 g，加無菌水50 mL，于攪拌器上攪拌打散1

12、0 min。取1 mL上清懸浮液于EP管中，即為101稀釋度的樣液，依次按十倍級差稀釋，即得一系列稀釋度的樣液。取0.1 mL不同的稀釋度樣液，涂布PDA分離平板，同一稀釋度可同時涂多個平板。然后倒置于28 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察一次。根據(jù)毛霉的菌落、孢子顏色及菌落形態(tài)分離毛霉，進(jìn)一步于光學(xué)顯微鏡下觀察確定。（2）初篩小心取分離得到的毛霉菌株的極少孢子，點種于脫脂乳平板中央。置于28 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈，并測量透明圈與菌落的直徑，挑選透明圈與菌落的直徑比大，即產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)的毛霉菌株進(jìn)行復(fù)篩。（3）復(fù)篩將初篩得到的產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)的毛霉菌株進(jìn)行平板活化，接

13、入麩皮培養(yǎng)基中，拍打均勻，于28 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，于48 h時翻曲一次。制備粗酶液，測定粗酶液的蛋白酶活力，選擇蛋白酶活力較高的毛霉菌株進(jìn)行下一步研究。1.2.2 毛霉蛋白酶粗酶液的制備將發(fā)酵好的麩曲搗碎，取適量，加入十倍體積的0.3 mol/L NaCl溶液，40 水浴提取1 h，過濾離心即得粗酶液。1.2.3 發(fā)酵豆粕水提物的制備將蛋白酶活力較高的毛霉菌株接入豆粕培養(yǎng)基中，拍打均勻，于適當(dāng)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后于豆粕發(fā)酵曲中加入10倍體積的蒸餾水，40 水浴浸提1 h，過濾離心即得發(fā)酵豆粕水提物。 1.2.4 蛋白酶活力的測定采用紫外光譜法6稍加改進(jìn)，于試管中加入1 mL酶液

14、，于40 水浴預(yù)熱2 min，再加40 預(yù)熱的2%酪蛋白溶液1 mL，精確反應(yīng)10 min后，立即加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸（TCA）以中止反應(yīng)，10 min后沉淀完全，離心。取1 mL上清液，加入對應(yīng)pH值的（同一樣品分別測定其Na2HPO4檸檬酸緩沖液5 mL在pH 6.0、7.0、8.0下的蛋白酶活力）。混勻后于275 nm下測吸光值。同時以先加2 mL TCA滅酶10 min后再加1 mL 2%酪蛋白的沉淀離心為空白對照。蛋白酶活力單位定義：1 mL液體酶在一定溫度和pH條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 g酪氨酸為1個酶活力單位，以U/mL表示。酶活力（U/mL）=（

15、A×K×V×n）/（t×m）式中A為樣品的吸光值；K為吸光常數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線中OD值為1時相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)；V為反應(yīng)試劑的總體積（mL）；n為酶液的稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間（min）；m為酶液體積（mL）。1.2.5 游離氨基含量測定取5 mL樣品，加入采用甲醛滴定法7稍加改進(jìn)，60 mL蒸餾水，用0.05 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8.20，加入10 mL已中和的甲醛溶液，混勻，用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 9.20。記錄消耗NaOH的體積V。用蒸餾水代替樣品，操作方法相同，測得空白957現(xiàn)代食品科技 Modern Food Sc

16、ience and Technology 2010, Vol.26, No.9體積V0。游離氨基的量(mmol/L)1000×N×(V-V0)/5.0式中V為樣品消耗的NaOH溶液體積，V0為空白體積，N為滴定所用的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度。乳平板上進(jìn)行活性顯色。具有蛋白酶活性的蛋白質(zhì)條帶會作用于脫脂乳平板中的酪蛋白形成透明帶。 2 結(jié)果與討論2.1 毛霉蛋白酶產(chǎn)生菌株的分離篩選從55份土樣中共分離得到68個毛霉菌株。毛霉菌落質(zhì)地疏松，呈棉絮狀或絨毛狀，菌絲體細(xì)密，呈雪白色。菌落低部不產(chǎn)色素，呈花瓣狀擴(kuò)展。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，其菌絲無橫隔，無假根，孢子囊呈球形，呈單軸分支，孢

17、子圓形。將68個毛霉菌株分別點于脫脂乳平板上，培養(yǎng)2 d后可以觀察到有一部分菌株周圍產(chǎn)生肉眼可見的水解圈。水解圈直徑和菌落直徑的比值(D/d)大于2.0的菌株共有11株，結(jié)果見表1。表1 產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩Table 1 Primary screening of the protease-producing strains 水解圈直徑和菌落直徑的比值（D/d）2.0菌株數(shù)量比例/%水解度DH(%)=(樣品中游離氨基的量/C-0.33)/7.8×100式中C為樣品中蛋白濃度(g/L)；0.33為大豆蛋白中游離氨基濃度(mmol/g)；7.8為每克大豆蛋白的肽鍵當(dāng)量數(shù)(mmol/g)。1

18、.2.6 大豆肽活性的測定（1）還原能力的測定在1 mL樣品（空白采用文獻(xiàn)8的方法稍加改進(jìn)，用蒸餾水代替）中加入2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液和2.5 mL的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），混勻后在50 保溫20 min，然后加入2.5 mL 10%的TCA，混和后10000 r/min離心5 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3，混勻后在700 nm下測定吸光度值。以Vc作為對照。（2）清除DPPH·自由基能力的測定采用文獻(xiàn)9方法稍加改進(jìn)，將2 mL無水乙醇與2 mL 250 mmol/L的DPPH（2,2-di

19、phenyl-1- picrylhydrazyl）溶液加入同一試管中，搖勻，避光反應(yīng)30 min，用無水乙醇作參比于517 nm下測定吸光度值A(chǔ)0；測定樣品清除能力時，將2 mL樣液與2 mL 250 mol/L的DPPH溶液混勻于同一試管中，靜置30 min，以同濃度樣液為參比測定517 nm處吸光度值A(chǔ)。 自由基清除率計算：清除率(%)(A0-A)/A0×100 （3）清除超氧陰離子自由基能力的測定采用鄰苯三酚自氧化法，根據(jù)文獻(xiàn)10的方法，在4.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2，內(nèi)含2 mmol/L EDTA）中，加入4.2 mL蒸餾水后于25

20、 保溫20 min，然后加入25 預(yù)熱的45 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL（空白管用10 mmol/L HCl代替）。迅速搖勻，立即在420 nm下測吸光度值，每30 s記錄一次，測4次，計算A0值。樣液加入4.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液中，減少相應(yīng)蒸餾水的加入量，其余同上。測定420 nm下吸光度值，每30 s記錄一次，測4次，計算A值。自由基清除率計算：清除率(%)(A0-A)/A0×100式中A0為鄰苯三酚的自氧化速率，A為加入樣液后鄰苯三酚的自氧化速率。11 16.21.52.0 28 41.229 42.6 1.5將11株D/d大于2.0的菌

21、株分別接種到麩皮培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)后提取粗酶液，離心取上清測定蛋白酶活力，結(jié)果見表2。從表2可知，HN201號菌株發(fā)酵后產(chǎn)生的酸性蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶活力均為最高，因此選擇該菌作進(jìn)一步研究。表2 產(chǎn)蛋白酶菌株的復(fù)篩Table 2 Secondary screening of the protease-producing strains 菌株號酸性蛋白酶活力(U/mL)中性蛋白酶活力(U/mL)堿性蛋白酶活力(U/mL)FC5 96.49 117.60 101.18 HN6 76.72 113.91 118.94 HN7 89.79 119.94 139.04 HN9 85.77 11

22、9.61 139.04 HN11 73.71 HN12 84.43 HN14 66.00 HN17 91.13 HN201HN202102.52 128.65 132.34 135.35 80.41121.28116.60 131.00113.91 144.73 177.23 92.80 144.06 125.30QZ1 71.36 125.30 135.021.2.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳和活性染色方法將毛霉產(chǎn)生的蛋白酶酶液進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為7.5%。電泳結(jié)束后將膠條一分為二，一半用考馬斯亮藍(lán)染色，另一半平貼于脫脂958菌株HN201發(fā)酵后產(chǎn)生的蛋白酶經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電

23、泳（PAGE）和在脫脂乳平板上活性顯色檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知，經(jīng)PAGE出現(xiàn)三條主要蛋白帶，經(jīng)活性顯色1 h出現(xiàn)一條水解帶，對應(yīng)考馬斯現(xiàn)代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010, Vol.26, No.9亮藍(lán)染色電泳遷移最慢的一條主帶。從這些結(jié)果可知，HN201主要產(chǎn)生一種蛋白酶。圖3 不同發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵水提物中游離氨基含量的影響圖1 HN201菌株發(fā)酵粗酶液非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖及蛋白酶活性顯色圖Fig.1 Polyacrylamide gel electrophoresis of the fermented soybean m

24、eal by HN201 and its protease activity analysis withdefatted milk plateFig.3 Effect of fermentation time on the free amino acidcontents in fermented soybean meal2.2 毛霉發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的初步研究2.2.1 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的影響 2.2.1.1 不同發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵的蛋白酶活力的影響測定了豆粕發(fā)酵中不同發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵蛋白酶活力的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，堿性蛋白酶活力在發(fā)酵72 h后達(dá)到最大值，為81.41

25、 U/mL，酸性及中性蛋白酶活力在發(fā)酵的96 h達(dá)到最大值，分別為79.40 U/mL和86.77 U/mL?？傮w來看，發(fā)酵培養(yǎng)到96 h的蛋白酶活力最高。2.2.1.3 不同發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵所得大豆肽肽活性的影響。（1）對大豆肽還原力的影響以Vc的還原力為100%作為對照，測定了不同發(fā)酵時間發(fā)酵豆粕水提物中的大豆肽還原力，吸光度值越大說明樣品的還原能力越強(qiáng)。由圖4結(jié)果可知，不同發(fā)酵時間發(fā)酵豆粕產(chǎn)生的大豆肽均具還原力，且發(fā)酵第96 h產(chǎn)生的大豆肽還原性最高，是Vc的85%左右。圖4 不同發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵所得大豆肽還原能力的影響 Fig.4 Effect of fermentation ti

26、me on the reducing activity of thesoybean peptide（2）對清除DPPH·能力的影響圖2 不同發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵的蛋白酶活力的影響 Fig.2 Effect of fermentation time on the activity of proteaseproduced by soybean meal fermentation2.2.1.2 不同發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵水提物中游離氨基含量的影響測定了豆粕發(fā)酵中不同發(fā)酵時間的豆粕發(fā)酵水提物的游離氨基含量，結(jié)果見圖3。由圖3可知，發(fā)酵水提物中游離氨基含量隨著培養(yǎng)時間的增加而增加。水解度與游離氨基含

27、量的變化趨勢一致，也隨培養(yǎng)時間的增加而增加，在發(fā)酵120 h時，游離氨基含量為77 mmol/L，水解度為47.4%。圖5 不同發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵所得大豆肽清除DPPH·能力的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the DPPH-scavengingcapability of the soybean peptide以Vc清除DPPH·的能力為100%作為對照，測定了959現(xiàn)代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010, Vol.26, No.9豆粕發(fā)酵中不同發(fā)酵時間發(fā)酵豆粕水提物中的大豆

28、肽清除DPPH·的能力，結(jié)果如圖5。由圖5可知，豆粕發(fā)酵48 h產(chǎn)生的大豆肽具有最高清除DPPH·的能力，約為Vc的60%。（3）對清除超氧陰離子自由基能力的影響測定了豆粕發(fā)酵中不同發(fā)酵時間發(fā)酵大豆水提物中的大豆肽清除超氧陰離子自由基的能力，分別以A0、A、A1、A2、A3、A4和A5表示鄰苯三酚自氧化速率、加入未發(fā)酵豆粕浸提液、培養(yǎng)36 h、48 h、72 h、96 h、120 h發(fā)酵豆粕水提物后鄰苯三酚自氧化速率，結(jié)果見表3。由表3可知，培養(yǎng)48 h和120 h時發(fā)酵豆粕產(chǎn)生的大豆肽具有弱的清除超氧陰離子的能力，且發(fā)酵120 h的能力大于發(fā)酵48 h?？傮w上看，大豆肽對

29、超氧陰離子清除能力不高。圖7 不同發(fā)酵溫度對豆粕發(fā)酵水提物中游離氨基含量的影響 Fig.7 Effect of fermentation temperature on the free amino acidcontents in fermented soybean meal2.2.2.3 不同發(fā)酵溫度對豆粕發(fā)酵所得大豆肽肽活性的影響（1）對大豆肽還原力的影響表3 不同發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵所得大豆肽清除O2·能力的影響 以Vc的還原力為100%作為對照，測定了不同發(fā)酵Table 3 Effect of fermentation time on the O-2·-scavengi

30、ng 溫度發(fā)酵豆粕水提物中的大豆肽還原力，吸光度值越activity of the soybean peptide 大說明樣品的還原能力越強(qiáng)，結(jié)果如圖8。由圖8可知，A0 A A1 A2 A3 A4 A5 不同發(fā)酵溫度發(fā)酵豆粕產(chǎn)生的大豆肽均具有還原力，0.0006 0.0006 0.0006 0.00050.0006 0.00060.0004且在28下產(chǎn)生的大豆肽具有最高的還原性，約是Vc的85%。2.2.2 不同發(fā)酵溫度對豆粕發(fā)酵的影響2.2.2.1 不同發(fā)酵溫度對豆粕發(fā)酵的蛋白酶活力的影響測定了豆粕發(fā)酵中不同發(fā)酵溫度對豆粕發(fā)酵蛋白酶活力的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，發(fā)酵96 h，堿性蛋白

31、酶的活力在30 下達(dá)到最大值；酸性及中性蛋白酶活力在28 下達(dá)到最大值?？傮w上看，在28 下豆粕發(fā)酵的蛋白酶活力可達(dá)最大值。圖8 不同發(fā)酵溫度對豆粕發(fā)酵所得大豆肽還原能力的影響 Fig.8 Effect of fermentation temperature on the reducing activityof the soybean peptide（2）對清除DPPH·能力的影響圖6 不同發(fā)酵溫度對豆粕發(fā)酵的蛋白酶活力的影響 Fig.6 Effect of fermentation temperature on the activity ofprotease in fermente

32、d soybean meal2.2.2.2 不同發(fā)酵溫度對豆粕發(fā)酵水提物中游離氨基含量的影響測定了不同發(fā)酵溫度對豆粕發(fā)酵水提物中游離氨基含量的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，在28 下豆粕發(fā)酵水提物中的氨基含量達(dá)最高值75.6 mmol/L，此時水解度也達(dá)最高值42.4%。960圖9 不同溫度對豆粕發(fā)酵所得大豆肽清除DPPH·能力的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on the DPPH-scavenging capability of the soybean peptide以Vc清除DPPH·的能力為100%作為對照，測定

33、了現(xiàn)代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010, Vol.26, No.9豆粕發(fā)酵中不同發(fā)酵溫度發(fā)酵豆粕水提物中的大豆肽清除DPPH·的能力，結(jié)果如圖9。由圖9可知，豆粕在26 的發(fā)酵條件下產(chǎn)生的大豆肽具有最高清除DPPH·的能力，約為Vc的50%。從總體上看，溫度對發(fā)酵豆粕水提物清除DPPH·自由基能力的影響不大。（3）對清除超氧陰離子自由基能力的影響測定了豆粕發(fā)酵中不同發(fā)酵溫度發(fā)酵豆粕水提物中的大豆肽清除超氧陰離子自由基的能力。實驗結(jié)果表明均不具有此活性。2.2.3 豆粕發(fā)酵提取物大豆肽采用SDS-PAGE電泳方法研究了豆粕發(fā)酵提取物的大豆肽，結(jié)果見圖10。由圖10電泳圖可知，毛霉發(fā)酵豆粕的提取物的大豆肽分子量集中在10 kD以下，說明利用毛霉