微生物工業(yè)化步驟

1、Clostridium ljungdahlii 菌種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)工作計(jì)劃一、菌種活化菌種活化包含兩步。首先是菌種復(fù)蘇，就是使處于保藏（休眠）狀態(tài)的菌 種蘇醒過來，恢復(fù)在一定培養(yǎng)條件下的生長代謝能力；活化是在菌種復(fù)蘇的基 礎(chǔ)上，通過在適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)來恢復(fù)和增強(qiáng)菌種 的活力。實(shí)際上菌種活化過程就是菌種復(fù)壯的過程，菌種發(fā)酵有一般需要2-3代的復(fù)壯過程，因?yàn)楸４鏁r的條件往往和培養(yǎng)時的條件不相同，所以要活化,讓菌種逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境。我們實(shí)驗(yàn)室菌種的保藏條件為-80 °C冰箱凍結(jié)法。適用的復(fù)蘇方式為：從冰 箱中取出凍存管，立即放置38 C-40 C水浴中快速復(fù)蘇并適當(dāng)快速搖

2、動。 直到內(nèi) 部結(jié)冰全部溶解為止， 約需 50 秒-100 秒。開啟凍存管， 將內(nèi)容物移至適宜的培 養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)?？傮w來講菌種活化需要以下幾個步驟1配置菌種適宜生長的培養(yǎng)基；2將冷凍的菌種解凍，使菌種從保藏狀態(tài)恢復(fù)到室溫狀態(tài)；3將通過操作將保藏的菌種接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此步驟稱為菌種復(fù)壯4挑選培養(yǎng)基茁壯的菌落，挑選其中部分菌落接種到新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 重復(fù)此步驟 2-3 次，從而得到生長良好的菌落經(jīng)過這四個步驟就到達(dá)將菌種從保藏狀態(tài)活化的目的二、菌種鑒定菌種鑒定的目的是判斷菌種是不是我們所需要的東西， 包括種的鑒定和生產(chǎn) 水平鑒定。1種的鑒定如果是比較熟悉的菌種就可以用常規(guī)鑒定，根據(jù)菌種的形

3、態(tài)特征（顯微形 態(tài)和培養(yǎng)特征）理化特性（營養(yǎng)類型、碳氮源利用能力、代謝反應(yīng)等）做出判 斷。不熟悉的菌種就得用分子生物學(xué)方法來鑒定。2生產(chǎn)水平鑒定菌種復(fù)壯后需要對生產(chǎn)能力進(jìn)行判斷。 生化指標(biāo)：可以通過其生長代謝過程中某些原材料的消耗量和中間代謝物的產(chǎn)量作為指標(biāo)，或者是這個菌株產(chǎn)生的酶或者是這個菌株產(chǎn)生的次生代謝物。 生理指標(biāo)：菌株如果復(fù)壯成功，他的生長量就會恢復(fù)到原來的水平或者更高。 特殊指標(biāo)：能夠利用特殊物質(zhì)作為生長必須物質(zhì)的菌株， 比如Clostridium jungdahlii菌株能夠利用CO CO和H2,可以在搖瓶內(nèi)通入 CO CO和H2進(jìn)行培 養(yǎng)，判斷其是否能夠正常生長代謝。三、菌種保

4、藏菌種保藏，是指為了使優(yōu)良菌種的性狀得以保持穩(wěn)定，人為地創(chuàng)造條件， 使菌種的新陳代謝活動處于不活潑狀態(tài)，即選取優(yōu)良菌種的休眠體（孢子或 芽孢）或富有生命力的懸浮液在低溫或脫水狀態(tài)下保存。低溫保存 簡單保存法，將瓊脂斜面孢子培養(yǎng)物、 菌絲懸浮液4C冰箱保存，保存時 間不超過12個月； 液氮超低溫保存法， 將生長穩(wěn)定期的細(xì)胞懸浮在 10%甘油或其他低冰點(diǎn) 液體中，密封于安瓿管內(nèi)，然后控制冷卻速度，使安瓿管溫度逐步下降至-35 C時，即可置于-150-196C的液氮罐中保存。大多數(shù)微生物如病毒、噬 菌體、多種細(xì)菌、放線菌、酵母和原蟲、特別是一些用冷凍干燥法有困難的 微生物，都可用此法長期保存。脫水保

5、存 冷凍干燥法 ,將孢子懸浮液與保護(hù)劑（一般用脫脂牛奶或血清）相混合， 放在安瓿管內(nèi)于-20-30 C的乙醇浴中速凍。然后，在低溫下用真空泵抽干， 并用五氧化二磷或干冰使水汽結(jié)凍，熔封安瓿管，于低溫下保存。保存期可 達(dá) 5 10 年之久。 石蠟油封存法，在斜面菌種培養(yǎng)物上，倒上滅菌后的石蠟油，高出斜面1cm，于4C冰箱或低溫干燥處保存，此法不適用于能利用石蠟油作碳源的微 生物，保存期為一年以上。四、菌種的代謝特點(diǎn) 在菌種活化和種子制備擴(kuò)大培養(yǎng)的同時要注意觀察和總結(jié)菌種的生理代謝特征，以便為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)放大提供依據(jù)。 這些特征包括： 培養(yǎng)基種類和用量 （配 置濃度）、酸堿度的喜好、溫度壓力的適應(yīng)性

6、等。五、種子制備 種子制備，是指菌種在一定條件下，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的純生產(chǎn)菌種的制備過程。以作接入發(fā)酵罐中進(jìn)一步擴(kuò)大菌體量及合成 產(chǎn)物之用。 Clostridium ljungdahlii 菌種宜采用搖瓶液體培養(yǎng)制得菌絲體，作為 下一工序的種子。作為種子必須具備以下幾個方面條件：生命旺盛有活力，移種至下一 工序后能迅速是在，縮短延遲期；菌體總量適宜，保證接種量；生理狀 態(tài)穩(wěn)定；無雜菌；保持穩(wěn)定生產(chǎn)能力。六、種子培養(yǎng)基的優(yōu)化以提高菌種生產(chǎn)能力、簡化培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)基成分替代、降低生產(chǎn)成本 為目的對種子培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。七、搖瓶實(shí)驗(yàn)在搖瓶規(guī)模上進(jìn)行菌種的發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，為放大積累經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)。八、發(fā)酵工藝優(yōu)化、放大以最終實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)為目的，在搖瓶實(shí)驗(yàn)積累的數(shù)