微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞工藝條件初探

1、|維普賢訊 rmp:/www.cqvip.coTfT|維普賢訊 rmp:/www.cqvip.coTfT|YdL 15 No» 4I fl « fl舉來佬工鄂配學(xué)議Jourtidl of Ea?< Chini lotjiirte of CbeniiEal Tecfattoloy微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞工藝條件初探繪殿勝華平王國敵侖仮集C ± 化工程研究所）宋-家靦味罰賞適民（衛(wèi)生 部上海 生物制晶研 範(fàn)所）寧文晉克丁期囂生抵過程中豪義井的井類T款良班觀罔曲捷拌水乎對培養(yǎng)V«ro !P胞的響亠在pH為T.QT". &KM水乎揚so&a

2、mp;Oti空弋18 翱找躍 ffi捽環(huán)度牌25-35 r/ffiin,沮庚曲371D時*在匚5開Olli姿口丁訊覃饒中， 痊縝培芥7衰2.5Kio*Cells/jDb為損帯的勢信*議舟主低 ££,爭逝正常f黃飼：細(xì)熬埋齊：幣霹老；Veresam大規(guī)摸斷孔動暢細(xì)她培騁超現(xiàn)代生物技術(shù)的一個麼要研究潁域，貼壁悵就性細(xì)SS的大畳 焙養(yǎng)包括滾瓶、蝶片式、多層平板*中空纖維，微膠蠶間定化細(xì)胞、微載住培養(yǎng)等多種芍 式:匕 自1967年Van Wezel, A. L.婦成功 地利用DEAE-Sephadex1 A50培養(yǎng)貼壁依棘性 動物細(xì)胞厲乘#巳應(yīng)用各種不同微戦體成功地培養(yǎng)了近百種細(xì)胞

3、審有工業(yè)應(yīng)用倫值的哺乳動物細(xì)胞大蚤為貼矍依頓性細(xì)胞，提供足夠丈的我面執(zhí)是大規(guī)模 培養(yǎng)的必要條件。國內(nèi)采用妁滾瓶法占地間積大*比表面積小.易進行培養(yǎng)過程的檢測與控 制°微載體培養(yǎng)系統(tǒng)，由于其此表面積大，可以懸浮培養(yǎng)，能茨現(xiàn)多種過程的檢測與控制. 正H益受到國內(nèi)外的重覘*國外已成功地應(yīng)用澈裁體培養(yǎng)系統(tǒng)”生產(chǎn)諸如狂犬疫苗，脊船灰質(zhì) 炎疫苗等"幕九規(guī)橫動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中.一些工藝參數(shù)對細(xì)胞生枝、繁殖和目的產(chǎn)物的獲取都有彰 響n本文就其中的細(xì)胞培許之微戰(zhàn)體種類、液度及溶解氧錚問題進f亍了研疣， «1材料和方法1.1 材料l.r 1細(xì)胞:Vero細(xì)胞萌圳錄猴腎細(xì)胞），由衛(wèi)生部

4、上海生物制品所提供”1.1.2培養(yǎng)基，傳代用培養(yǎng)菇：EMEM,加小牛血清，慶大待素，用NaHCOa 節(jié)pH至 T47.卅1升反應(yīng)器系統(tǒng)培養(yǎng)基：EMEM,水辭乳哥白液，小牛血清卜慶大務(wù)素十用NaHCOj iffl Vj pFi 壬113 穂釀緩4（PBSJt pH7.07,2、1. L 4 淡我體；Cytodex ! （Pharmacia Fine Chemicals）：吃工自制 1 號埶栽體，類 Cytodex 系 列（華東化工學(xué)院生化工程研究所研究*）。15反環(huán)會屮5升田丄欣叮4蜩胞培養(yǎng)系統(tǒng)美凰NBS公衛(wèi)產(chǎn)乩）.1 # 占, J1.2 方法1*2-1微栽體的預(yù)處理及況菌：稱耽一宦駅的微救體置

5、于硅化過的班墉客器屮，50 ml/g 加人磷酸緩沖液，pH7.07.2f充分洗滌，3小時后更換磷戰(zhàn)緩沖液，溢泡過液，再決更換 阿酸韁沖液，餐石于J2J t； 菌30分鐘，使用前加&適員的培祥堪浸泡辻與L1 2.2 細(xì)臉培養(yǎng)：將滅菌的微狀偉與一定數(shù)最的¥"。細(xì)胞接觸（由細(xì)翹接種缸聽決宅）， 闕胞貼M間為3小射,間隙攝昇p培養(yǎng)圭徳積為約體積的1/3左右"砧墅扁將卅細(xì)胞的微 我體轉(zhuǎn)* 1.5 Jf-反應(yīng)弘 外加新鮮培養(yǎng)基至終體積（約,2升人控制細(xì)胞焙養(yǎng)條件,pH為 7.0-7.4,容解報為.80%&50%空竽徳和彼度4攬拌速應(yīng)為25-35 r/mln,龍

6、度為3T J 每隔24小時取胖分析，細(xì)施計較：矗察糾腕生長形.態(tài)及生按情況©k2.3細(xì)胞的收獄沒計數(shù)：取完履的培養(yǎng)謹(jǐn)，沉條后換掉王潸液，拙人釀酶消化，細(xì)胞 從徹載體上脫落后離心去上禱液，準(zhǔn)確加人一左饑的培養(yǎng)基，庇血球計數(shù)更上進行細(xì)腕計 敖蔦-1,2.4細(xì)臉晤態(tài)斕咯：痔次取禪后，吸取少量含有微載體的培養(yǎng)棊于披玻片上，在倒獸顯微鏡上觀察細(xì)胞形磬.井拍下紗胞生任鶻片。»八！，:2“結(jié)果寫奇込.1*“”MI1J 微栽體種無與細(xì)胞踮整舉采jg Pharmacia的Cytcdex 1與化工自制 1號緻戟朿在栢同的培養(yǎng)條件下比較不同微 熬離電貼璧、生長特性"細(xì)胞接禪童為Hox

7、1 Cls/ml,殺載牡濃度為2.00/U 第四天 更換50%的培養(yǎng)基，在1.5升Colligo陽反應(yīng) 辭上培養(yǎng)*培養(yǎng)條件同箭述亡圖1為”細(xì)胞 在不同薇載休上的砧劈速率。從圖1旬,化工自制1號微戟體在杲初的 【5小吋,細(xì)胞的貼壁率稍遜于Cytodex 1,但 隨著時間的增加*二者闔貼壁率逑步相近3 小時時*兩種微載體的貼壁沫均已達 眥 洌 小時的取樣觀察表明.無論使用那一種哉載體 作細(xì)胞貼鑿介質(zhì)，培養(yǎng)基中已基本無游離細(xì)胞 存在，細(xì)腕躍閑種微載體上的貼壁率幾乎都達r/h圈1 Ycro卿曲在不河載悴上的貼豊盍勲 CftfFA 2.010' Cels/mlt ft®萍液At 2.0

8、 g/L > Flgl. 1 Rate of Veto cell *att&cliittPne to different microc«riers< V)<Inoculation dtnsitjf： 2.0X105 CeHs/mJ., Mkrorarrier concntratj on ； 20 g/L)M2| 維普資訊 h ttp:/圖a瓏載味浚盧曲細(xì)16生長的審咱C ftlfr-H 2.010' Cells/ml >Fig. 3 Effect oJ microearrier concptr-i'tirn on cell grow t

9、h(ItlqcuI at ion dem it y： 2 0m iqs CtLl 裡/ud?MEdT WW1W呂 p 13暫IRepSsccoient到100%,細(xì)胸生比形態(tài)正常。圖2為不同薇載邙時¥亡誼細(xì)跑生楓的崽響&從圖2知：兩種羊司的微栽體均適應(yīng)于Vero細(xì)胞的培養(yǎng)，二者具有幾乎相同的生長速 度。細(xì)腕在這兩種微載休上生民旺盛*形態(tài)正常中綜臺圖X圖2的細(xì)胞妙壁、生忻曲線可知：Vro細(xì)胞在這兩種微載體上幾乎有相同的 貼圈，笙長特性，二者無明顯差別，國產(chǎn)的微載體可以替R Pharmacia Cytdex I而用于大 規(guī)模Vtsro細(xì)胞墻養(yǎng)。16.0田2 不同J*載悴能譏蝕期胞

10、蔓K:倫響I按種2.0XCelJ£/ntL懐謎障敢度；S'Og/L Fig. 2 Effect bl differtot ntirrncarri£/fi an Vera cell, gfolb< Ictillation JentU/ 2x CtUsAul iMirmcarrier concaittratjGn： ZOg/Ll尸，、二K2微載體濃度對細(xì)胞生於跑影響采用Cyg嚴(yán)"微載體并加人拒冏的細(xì)胞接種量“弋3Cag/ml),而微戦體儂度分 別為2-0 g/L和隊。耳/“ 其它培養(yǎng)條件同前.其細(xì)胞生撓結(jié)卑如圖3所示。在開始生長階段，細(xì)胞在兩種不同濃度的

11、徹載體上的生長速度基本柑同，在中后期*微載休濃度高的，細(xì)胞生長速度快。除了在下面將要討淪的"細(xì)胸接紳罐甘細(xì)胞生民的圣響”的原因外片低濃度微載徉上細(xì)胞已基本匯合,可供細(xì)胞生氏的面聊減少，而在髙濃度微載體上還有較大的生長面積可供細(xì)胞生長，因此，適當(dāng)提高微載體的濃度，給釧胞提供盡可能天的 生長表面"對提高細(xì)胞的終空度是有益的°3'* » 2.3細(xì)胞趙種:對細(xì)胞拄悵的好響采用箱崗的微載體液度(2.0 g/L),細(xì)胞接種屋分別為1.0X10* ft 2,0x0SCdk/nilt做載體為化丄自制1號，其它培養(yǎng)來件同前，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果見圖億1日QlAfr進厲由圖

12、可知，不同濃度接種毘的細(xì)胞，第一天,幾乎都未増長，第趴3天幾乎以相同囲速率培 氐 在第4天換液局 細(xì)胞的半長遲率又有所前長白最后，雖然兩組接種雖之細(xì)胞均能在橄 載體上長滿*達到同一誼和密應(yīng)，但高接種屋組只需？天時間（細(xì)胞濃度2.4X1O« Ceils/ ml）,而低接種鼠組要9天（細(xì)胞7ft«2.4xiQ* Ctells/ffil 且中間要換兩次培養(yǎng)荃才能達 到飽和密度,而高接種組只妾一次換液即能達到誼和翹度V據(jù)文厭報道Vero細(xì)胞的臨界 接種量為5入細(xì)胞/每個微救體，Cylodex 1每克約有S + 8xio6個微栽休，故以每升培養(yǎng)基 含2克Cytodex 1計，則臨界接

13、種屋約為7 x 10* Cells/ml,上述實驗中所釆用的接種濃度都 那過了臨界接種凰.細(xì)胞在機裁體上的生畏只與環(huán)境因素相關(guān)。從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮，縮短 培養(yǎng)周期*減少換覩次數(shù).于降低成本.盡快進行到下一步工藝培養(yǎng)或分泌產(chǎn)物.減少詩染 都是有益的，囲此，在2 ? Cy to to t/L堵養(yǎng)基的條件下*絢胞橫種咼以HPCehs/ail為 宜4'.Rep!«cemento 1.0 xCdls ml-*f/dffi 4捷種處討¥癡“翔生崔的Fj& Effect of c-ell iuoculation densityon Vera cell growth* 2.

14、0Cells*ml-19 &不聞前僭訴氛感平瞄覽由生醫(yī)抽甫 £接種*; 2,410' Cells/ml,極*佯駛度：ig/L)Fi爭 $ Effect qF dJslved Qcygea level cm Vero c«H growthKliicculation defliity： 2h4KtOa CeJIs/cnL Mitrcrcarrkt1 cancentratioft； 2 g/L)2漕解駅水平的老響研憲中使用2g/L的化工自制1號微裁體，細(xì)胞接種濃度為ExlOCells/ml,溶解氧 朮平分別為30%和50%空氣徳和氓度.其它培養(yǎng)條件同前.其細(xì)胞圭長

15、結(jié)果見圖齢夙圖中可知*在相同接荊量彖件下，珞解戦水平高一細(xì)聴生長誨鷹快*隨著壤養(yǎng)過程的進行，這一墨距更明顯當(dāng)涪解戟水平高的一組細(xì)胞濃度達到時，溶解氧 水平低的一組細(xì)胞濃度怏為！這說明.對仇w細(xì)胞培養(yǎng)，狂其它條件相同 時，適當(dāng)提高培養(yǎng)的溶解氧水平，更在利于細(xì)腿的生長和代謝，特別是在細(xì)胞對數(shù)生隹期* 細(xì)胞生長旺盛，對落解窣的需要量較大，溶解氧的提高無疑是有利的。但是，動物細(xì)胞對氧 環(huán)境比徹生物更敏感，渚解氧水平過高，則對細(xì)胞有毒害作用，而涪解氧水平過低，又可能 愷細(xì)胞生長需靈不夠，由有氧呼職轉(zhuǎn)為厭報呼吸*導(dǎo)致培養(yǎng)基中大量乳麗等積累二使細(xì)胞 的生氏，代謝受到影響，PH 控制困璀。2*5細(xì)膻在微載體上

16、的生快過程采用Cytodex 1微載體，其濃度為2.0 g/L?細(xì)胞接種量為2.0 x 10j Cells/ml, 解氧 為30%的飽和空氣濃度，在第四天更換50%的培養(yǎng)基口經(jīng)過F天培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)2細(xì)胞在微載體裘面上可Q不斷地生良、卿痕，形成一個致密的單層，甚至在某些徽載體上會多屋生 怪，出現(xiàn)“架橋”現(xiàn)象可參見團6 ) o研究中采取每隔24小時取樣分析一次，進行細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胸形態(tài)觀察、其細(xì)胞濃度見圖九國6Fig- G Bridge of cells on inkrocatrir .B 7範(fàn)義體上Vere綿胞的主養(yǎng)曲霍£接評 2.QJUF CpUs/diI僮嶽休誑度e/L ) F辿 7 G

17、rowth raft of Ver« cell on mkrocjrrifr (InaculAtkMi density： 3,0 K10s CflE/mLMicrorarritr rnuceritraiiDn： 2.0 百如圖F所示，誼細(xì)腕在接種墳莽最初的 24小時內(nèi)，細(xì)施濃度在注本會明顯增加，有時1r圉8納胞孫黴我陣上雖悴就炭蠡Fj勒-& V«ro ctlJ spretidiDg od microcairier述會出現(xiàn)稍微減少的現(xiàn)象，這可能是山于Vero 細(xì)胞在微載體表面附著后有一段滯后的適應(yīng) 期,加附著的細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境，特別昱攪樣引 起的剪切力十分敏感，有可能他

18、剛附箱的細(xì)血 從徹載體上落下來，成為游藹細(xì)胞，便計數(shù)結(jié) 果稍有下降所有細(xì)胞濃度均指站離在微載體 上的細(xì)胞濃度人經(jīng)過一夭的培養(yǎng)，Veto細(xì)胞已 逐步適應(yīng)了培養(yǎng)環(huán)境，細(xì)胞已昱明顯的伸展?fàn)?蠱，見圖呂。過了滯后期虎后，細(xì)腕進人指數(shù) 生長肘段，在26天內(nèi)生長相當(dāng)活躍，細(xì)胞疤 l態(tài)正常v經(jīng)了天培養(yǎng)細(xì)胞濃度2.5X 106 Cells/mh為接種凰的12饑咄迪巴丄帯栽體上 長滿，參見圖6 口與現(xiàn)行的常規(guī)大規(guī)摸細(xì)胞培養(yǎng)滾瓶法相比較，在一只10升旳滾瓶中，內(nèi)裝2 QOOm)境養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞達致密單層后，可獲得終濃度為4.0X10= CcllE/ml的V已旳細(xì)臉，按徹 軟體淡度ZOg/L，培養(yǎng)基1 ”2升，紙

19、胞終濃度為2.4X106 Cells/ml計算，只1冷升 Celligen 器所獲得的細(xì)胞相蚩于4只10升滾瓶所收獲的細(xì)胞堡，而培養(yǎng)基消耗僅為滾 瓶的1/心 醫(yī)此，大量微載體培養(yǎng)¥“。細(xì)胞是可行的口參 奢，文 獻.1主留吹一見：中西生站化學(xué)會工業(yè)生牝哥業(yè)壷員會堆,，動卿細(xì)胞大St培琴'西安：金國鶴二按工業(yè)生化學(xué)幸僉說燎逹抿吿：I対7：t Ven.Wezel A L, Nattiret 1967； 21G; 643 Pharmacia Fine Chexoica也 Micro carrier CeH Culture- Pr inci pies and Methods, Si*e

20、d?n: PfaarDicia Fine Chtmicalj AB, 1981- 13S.£ ¥»n Wcztl A L* Develop Biol Standard, 19T8: <1 lEfl5 Van We«l A L et 町.ibidt斗屍 151E 張書元鳥L吃華車化工學(xué)睨學(xué)眾E, 1轉(zhuǎn)9； 15(1)： 1-47 Krase P F* Patterson M K. M icrocarrier' CuliurEs of Animal Celis. I u： Tmur CiJ/ure： M tri had s and AppUca

21、fiQn. Nw York; Academic, l/S； 3721778 Hn'W S and Wan D L Bioiechmtl Si&pn198S； 27<g): 5S59 Amt Nahwpe淞n Et at J Celt Scir *g朋；81： C5Study on Vero Cell Culture Technique with Microcarriers% _Xu Dianiengr Dong Shupett Hua Ping, Wang Guxhen and Yu Junt<mg,ii(Eosf Chiw Univer si iy Qj Chemical Technology Shanlar)Song Chn Lieshen a