分子生物學技術和食源性致病菌的快速檢測ppt課件

1、分子生物學技術和食源性分子生物學技術和食源性致病菌的快速檢測致病菌的快速檢測 與細菌有關的一些分子生物學和與細菌有關的一些分子生物學和 細胞生物學技術細胞生物學技術;PCR技術技術;熒光熒光PCR技術技術;相關的一些分子生物學技術在食源性致病菌相關的一些分子生物學技術在食源性致病菌 的快速檢測技術中的應用的快速檢測技術中的應用;5. 一實例分析個案一實例分析個案與細菌有關的一些分子生物學和與細菌有關的一些分子生物學和細胞生物學技術細胞生物學技術核酸的抽提與純化核酸的抽提與純化(DNA, RNA, 質粒質粒DNA等等)相關核酸的鑒定相關核酸的鑒定(PCR, 限制性內切酶和酶切技術及限制性內切酶和

2、酶切技術及 產物分析產物分析, 重組技術重組技術, 探針探針, Southern blotting, Northern blotting, 芯片技術芯片技術, 序列分析等序列分析等)蛋白質的提取與純化蛋白質的提取與純化相關蛋白質的鑒定相關蛋白質的鑒定(Western blotting, 抗原抗體復合物抗原抗體復合物, 標記技術標記技術,芯片技術芯片技術, 序列分析等序列分析等)培養(yǎng)細胞技術培養(yǎng)細胞技術(用于細菌毒素測定的用于細菌毒素測定的MTT方法方法)核酸的抽提與純化核酸的抽提與純化DNA-微量法微量法(平衡酚平衡酚, 氯仿氯仿,乙醇乙醇);大量法大量法(堿堿列解列解); 離心法離心法RNA

3、質粒質粒DNA -堿變性法堿變性法, Kit-Qiagen公司公司PCR產物產物- Kit細菌細菌-直接裂解直接裂解:釋放出釋放出DNA PCR- PCR-聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCRPolymerase Chain Reaction, PCR）在體外通過酶促反應進行一段特定在體外通過酶促反應進行一段特定DNADNA或或RNARNA片段擴增的片段擴增的技術為獲取目的技術為獲取目的DNADNA片段的一項常規(guī)技術片段的一項常規(guī)技術( (診斷和檢測診斷和檢測) )原理原理: :PCRPCR一般過程：一般過程： 1.1.變性變性denatu

4、rationdenaturation）：）： 加熱使加熱使DNADNA雙螺旋的雙螺旋的氫氫鍵斷裂鍵斷裂, ,雙鏈解離形成雙鏈解離形成單單 鏈鏈DNADNA。 2.2.退火退火anneallingannealling）：）： 溫度降低時使引物溫度降低時使引物和其和其互補的模板在局部形成互補的模板在局部形成雜交鏈。雜交鏈。 3.3.延伸延伸extensionextension）：）： 在在DNADNA聚合酶和聚合酶和4 4種種脫脫氧核糖核苷酸及氧核糖核苷酸及Mg2Mg2存在存在的條件下，催化的條件下，催化DNADNA鏈鏈延延伸反應。伸反應。 模板模板DNA DNA 或或RNARNA 一對寡核苷酸引

5、物一對寡核苷酸引物 4 4種脫氧核糖核苷酸種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)(dNTPs) 熱穩(wěn)定的聚合酶熱穩(wěn)定的聚合酶(Taq)(Taq)； Mg+Mg+緩沖液。緩沖液。PCR-PCR-聚合酶鏈式反應體系聚合酶鏈式反應體系凝膠電泳：經溴化乙錠染色，在紫外照射下可見橙凝膠電泳：經溴化乙錠染色，在紫外照射下可見橙紅色的特異紅色的特異DNADNA擴增帶并可以在圖象成像儀下成像。擴增帶并可以在圖象成像儀下成像。PCR-PCR-聚合酶鏈式反應產物的檢測聚合酶鏈式反應產物的檢測M 1 2 3 4 5 6 7 8 N P PCR-PCR-聚合酶鏈式反應技術的發(fā)展聚合酶鏈式反應技術的發(fā)展不對稱不對稱PCR反向反

6、向PCR多重多重PCR差別差別PCR熒光熒光PCR錨式錨式PCR重組重組PCRPCR固相分析固相分析免疫免疫PCR反轉錄反轉錄PCR(RT-PCR)原位原位PCR熒光熒光PCR技術技術(Real Time PCR)熒光熒光PCR技術技術(Real Time PCR) PCR + 熒光標記 + 監(jiān)測系統(tǒng)uNon-specific DNA binding dyesuSYBR Green IuEthidium Bromide uSpecific Hybridization ProbesuTaqManTM umolecular beaconsudual-oligo FRET pairs熒光熒光PCR技

7、術技術(Real Time PCR)R5335RRRRSYBR Green I 是一種結合于小溝中的雙鏈是一種結合于小溝中的雙鏈DNA染料染料,與雙鏈與雙鏈DNA結合后結合后, 其熒光大大增強其熒光大大增強.RRR497nm520nm熒光熒光PCR技術技術(Real Time PCR)RQ5335R=ReporterQ=Quencherprobe熒光熒光PCR技術技術(Real Time PCR)FRET Probes5353l3DR5DetectionExtension Step531. Strand DisplacementSystem Silent2. PolymerizationCom

8、pleteSystem Silent5335Taq3DR1-5 basesDRTaq5R5熒光熒光PCR技術技術(Real Time PCR)閾值線閾值線CT值值閾值線閾值線: 熒光閾值的缺省的設置是熒光閾值的缺省的設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準差的個循環(huán)的熒光信號的標準差的10倍倍.CT值值: 各反應管內的信號到達設定的閾值所經歷的循環(huán)數各反應管內的信號到達設定的閾值所經歷的循環(huán)數.熒光熒光PCR技術技術(Real Time PCR)閾值線閾值線 CT值值多重熒光多重熒光PCR技術技術FAMVICHEXTETCy3Texas RedROXCy5LC640Cy5.5LC705490nm6

9、60nmR限制性內切酶和酶切技術及重組限制性內切酶和酶切技術及重組限制性內切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶. 例如: EcoRI 可以識別5.G AATTC.33.CTTAA G.5 粘性末端T4連接酶: 重組 酶切與多態(tài)性分析技術, GFP-MIP重組結構重組結構MIPmip基因是軍團菌的巨嗜細胞感染增強子基因，具高度保守性和嗜肺軍團菌種的特異性。表達的產物mip蛋白是迄今所公認的嗜肺軍團菌毒力因子之一，是嗜肺軍團菌所特有，因此用來鑒定軍團菌具有很強的特異性。GFP-MIP重組結構重組結構Southern blottingSouthern blotting和和No

10、rthern blottingNorthern blotting技術技術 R6 GFP-ras -Gp +Gp -Gp +Gp -Gp +Gp -Gp +Gp4 10 4 10 days raf(2.5 kb) Actin28S18S主要步驟主要步驟:DNA(RNA)提取提取 和純化和純化;凝膠電泳凝膠電泳;印跡轉移印跡轉移;探針和雜交探針和雜交顯色顯色芯片技術芯片技術主要步驟主要步驟:芯片的制備芯片的制備DNA(RNA)提取提取 和純化和純化;探針的制備探針的制備雜交雜交顯色顯色結果判讀結果判讀芯片技術芯片技術 -Gp +Gp芯片技術芯片技術T I II III IV C C登革熱病毒檢測芯

11、片: 通用探針的設計, 合成和篩選, 修飾分型探針的設計, 合成和篩選, 修飾預試驗, 樣品的處理;雜交及洗滌, 條件優(yōu)化等數據庫的建立應用評價與多重PCR技術的比較DNA序列分析序列分析雙脫氧測序雙脫氧測序(Sanger法法)化學測序化學測序(Maxam-Gilbert法法)同位素標記測序同位素標記測序市售商品或公司運作市售商品或公司運作DNA序列分析序列分析 Start-ATTAGACGTCCGA” T G CA ATTAGATTA ATTAGACGATTAGA ATTAGACGTCCG AT ATTAGAC ATT ATTAGACGTC ATTAGACGT ATTAGACGTCG A T

12、 G C - ATTAGACGTCCG - ATTAGACGTC - ATTAGACGT - ATTAGACG - ATTAGAC - ATTAGA - ATTAG - ATTA - ATT - AT - A測序凝膠測序凝膠DNA序列分析序列分析(I)DNA序列分析序列分析(II)DNA序列分析序列分析(III)Western blottingWestern blotting技術技術 0 2 4 8 0 2 4 8 days R6 GFP-ras 76 kD44 kD44 kD42 kDAnti-Raf-1Anti-ErkAnti-p-ErkAnti-ActinGp treatment主要步驟

13、主要步驟:蛋白質的提取蛋白質的提取 和純化和純化;SDS-聚丙酰胺聚丙酰胺 凝膠電泳凝膠電泳;印跡轉移印跡轉移;抗體和雜交抗體和雜交顯色顯色膠體金檢驗法膠體金檢驗法氯化金在還原劑作用下氯化金在還原劑作用下, 可聚合成一定大小的金顆?？删酆铣梢欢ù笮〉慕痤w粒, 形成帶負電的形成帶負電的疏水膠體溶液疏水膠體溶液(膠體金膠體金). 膠體金標記就是蛋白質等高分子被吸附到膠體金標記就是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包埋過程膠體金顆粒表面的包埋過程. 由于金具有高電子密度的特性由于金具有高電子密度的特性, 我們可我們可以在顯微鏡下或是在有相應的配體處大量聚集時以在顯微鏡下或是在有相應的配體處大量聚

14、集時, 肉眼可見紫色的肉眼可見紫色的標記標記.CTCTCTCT霍亂弧菌霍亂弧菌O1群群(O139)快速檢測卡快速檢測卡: T-霍亂弧菌霍亂弧菌O1群群(O139)單克隆抗體單克隆抗體 C-羊抗鼠抗體羊抗鼠抗體細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)的一般過程細胞培養(yǎng)的一般過程(細胞細胞, 培養(yǎng)基培養(yǎng)基, 實驗室要求的條件等實驗室要求的條件等)細胞的復蘇細胞的復蘇細胞的傳代細胞的傳代細胞的收獲細胞的收獲細胞的凍存細胞的凍存細胞培養(yǎng)污染的防治細胞培養(yǎng)污染的防治培養(yǎng)細胞的觀察等培養(yǎng)細胞的觀察等MTT Assay原理原理: 黃色的黃色的Tetrazolium Salt (MTT)在活細胞線粒體在活細胞線粒體S

15、DH酶的酶的作用下作用下, 生成藍色產物生成藍色產物. 根據顏色的濃度來判定活細胞的數目根據顏色的濃度來判定活細胞的數目, 從而推斷受試物的毒性大小從而推斷受試物的毒性大小.050100150R6R6-ras% Cell viability0 32 63 125 250 500 1000 2000MTT Assay g有關的一些分子生物學技術在食源性有關的一些分子生物學技術在食源性致病菌的快速檢測技術中的應用致病菌的快速檢測技術中的應用PCR技術技術;引物的設計引物的設計(kit, 文獻文獻, 自行設計自行設計, 原則原則, gene bank); PubMed: /e

16、ntrez/query.fcgi多重多重PCR; 熒光熒光PCR;分子分型及相關技術分子分型及相關技術(結合細菌特征基因結合細菌特征基因PCR和限制和限制性片斷長度多態(tài)性分析性片斷長度多態(tài)性分析PCR-RFLP, 核糖體基因分型核糖體基因分型Ribotyping, 脈沖場電泳脈沖場電泳Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE),同源性分析同源性分析, 溯源和預警等溯源和預警等霍亂霍亂CtxA基因的基因的PCR霍亂霍亂CtxA基因的基因的PCR霍亂霍亂CtxA基因的基因的PCR 1 gaattcccgg gttgtgggaa tgctccaaga tcatcg

17、atga gtaatacttg cgatgaaaaa 61 acccaaagtc taggtgtaaa attccttgac gaataccaat ctaaagttaa aagacaatat 121 ttttcaggct atcaatctga tattgataca cataatagaa ttaaggatga attatgatta 181 aattaaaatt tggtgttttt tttacagttt tactatcttc agcatatgca catggaacac 241 ctcaaaatat tactgatttg tgtgcagaat accacaacac acaaatatat acgct

18、aaatg 301 ataagatatt ttcgtataca gaatctctag ctggaaaaag agagatggct atcattactt 361 ttaagaatgg tgcaattttt caagtagaag taccaggtag tcaacatata gattcacaaa 421 aaaaagcgat tgaaaggatg aaggataccc tgaggattgcatatcttact gaagctaaag 481 tcgaaaagtt atgtgtatgg aataataaaa cgcctcatgc gattgccgca attagtatgg 541 caaattaaga

19、tataaaaaaa gcccacctca gtgggctttt ttgtggttcg atgatgagaa 601 gcaaccgttt tgcccaaaca tgtattactg caagtatgat gtttttattc cacatcctta 661 gtgcgtatta tgtatgttat gttaaattaa ggcataaaaa gaggtcgcaa accccaatct 721 gctccctatt cttaatccag cattaaacat aactgtattt accataaaat acctaataat 781 catatttatc atttgacaat gttaagtat

20、g attattatgg acattggcac tgtacttacg 841 tcaattgtgt gcaccaaagt g霍亂霍亂CtxA基因基因PCR擴增毒力基因所用引物序列及擴增產物分子量擴增毒力基因所用引物序列及擴增產物分子量毒力相關基因毒力相關基因引物序列（引物序列（53）擴增產擴增產物長度物長度（bp）編碼產物編碼產物aceTAA GGA TGT GCT TAT GAT GGA CAC CC CGT GAT GAA TAA AGA TAC TCA TAG G289AcetcpACAC GAT AAG AAA ACC GGT CAA GAG CGA AAG CAC CTT CTT T

21、CA CAC GTT G453TcpctxACGG GCA GAT TCT AGA CCT CCT GCGA TGA TCT TGG AGC ATT CCC AC564CTZotTCG CTT AAC GAT GGC GCG TTT T AAC CCC GTT TCA CTT CTA CCC A947ZotPCR擴增霍亂毒力基因及擴增產物分子量擴增霍亂毒力基因及擴增產物分子量 M 1 2 3 4 ZotctxAtcpAace多重多重PCR最早用于缺少基因片斷的檢測最早用于缺少基因片斷的檢測; ;用于多基因的同時檢測或進行細菌的屬用于多基因的同時檢測或進行細菌的屬, , 種種, ,型以及特異型以

22、及特異性基因段的同時檢測性基因段的同時檢測; ;對豬鏈球菌對豬鏈球菌2 2型型: : 檢索檢索GenbankGenbank中豬鏈球菌的屬、種及中豬鏈球菌的屬、種及毒力基因的基因序列，利用毒力基因的基因序列，利用Primer 5.0Primer 5.0軟件設計針對軟件設計針對hemolysin genehemolysin gene溶血素基因）、溶血素基因）、epfepf基因、基因、NADNADP PH-H-dependent glutamate dehydrogenase genedependent glutamate dehydrogenase geneNADNADP PH H依賴性谷氨酸鹽脫

23、氫酶基因）、依賴性谷氨酸鹽脫氫酶基因）、rmlACBDrmlACBD基因進行引物基因進行引物設計設計, , 以后再按照國家以后再按照國家CDCCDC的有關指引補充了針對豬鏈球的有關指引補充了針對豬鏈球菌種特異性菌種特異性16S rRNA16S rRNA片段和特異性莢膜多糖基因片段片段和特異性莢膜多糖基因片段cps2Jcps2J的特異引物的特異引物. . 多重多重PCR擴增霍亂毒力基因擴增霍亂毒力基因 M 1 2 3 4 5 ZotctxAtcpAace1000200 M 1 2 3 4多重熒光多重熒光PCR技術及應用技術及應用FAMVICHEXTETCy3Texas RedROXCy5LC64

24、0Cy5.5LC705490nm660nmRRQ53probeRQ53RQ53RQ53多重熒光多重熒光PCR技術及應用技術及應用沙門氏沙門氏, 志賀氏志賀氏;霍亂弧菌霍亂弧菌;副溶血性弧菌副溶血性弧菌, 病原性大腸埃希菌病原性大腸埃希菌(出血性大腸桿菌出血性大腸桿菌O157：H7，致病性大腸桿菌、產毒性大腸桿菌、侵襲，致病性大腸桿菌、產毒性大腸桿菌、侵襲性大腸桿菌性大腸桿菌)，變形桿菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄，變形桿菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸結球菌、單核細胞增生李斯菌、蠟樣芽孢桿菌、小腸結腸炎耶爾森菌腸炎耶爾森菌;空腸彎曲菌空腸彎曲菌;厭氧菌厭氧

25、菌(空彎空彎, 產氣莢膜梭菌產氣莢膜梭菌, 肉毒梭菌肉毒梭菌);分子分型及相關技術分子分型及相關技術意義意義:1.歐洲和美國歐洲和美國 等已成立了細菌分子分型國家電子網絡等已成立了細菌分子分型國家電子網絡PulseNet),包括沙門菌、志賀菌、彎曲菌、出血性大包括沙門菌、志賀菌、彎曲菌、出血性大 腸桿菌腸桿菌O157：H7、李斯特菌、耶爾森菌和弧菌、李斯特菌、耶爾森菌和弧菌 ）;2.國內尚無細菌分子分型的數據庫和網絡運作系統(tǒng)國內尚無細菌分子分型的數據庫和網絡運作系統(tǒng) ;3.沒有在溯源、食源性疾病沒有在溯源、食源性疾病(食物中毒食物中毒)疫情判斷和確認疫情判斷和確認 及預警的實際工作中應用及預警

26、的實際工作中應用 分子分型及相關技術分子分型及相關技術近十年來發(fā)展并應用了多種以直接分析基因多態(tài)性為依據的近十年來發(fā)展并應用了多種以直接分析基因多態(tài)性為依據的高分辨率的分子分型系統(tǒng)，包括：高分辨率的分子分型系統(tǒng)，包括：用低頻率（用低頻率（30%）的內切酶裂解）的內切酶裂解DNA，通過脈沖場凝膠，通過脈沖場凝膠電泳電泳PFGE將切成的大片段分開，根據條帶的大小及數量將切成的大片段分開，根據條帶的大小及數量差異來分型的差異來分型的PFGE；限制性酶切與限制性酶切與Southern印跡雜交技術結合，采用印跡雜交技術結合，采用rRNA或或rDNA序列探針的核糖體基因分型序列探針的核糖體基因分型Ribo

27、typing）；）；以以PCR為基礎的的限制性片段長度多態(tài)性分析為基礎的的限制性片段長度多態(tài)性分析PCR-RFLP），擴增片段長度多態(tài)性分析），擴增片段長度多態(tài)性分析AFLP）、隨機擴增多）、隨機擴增多態(tài)性態(tài)性DNA分析分析RAPD以及多位點序列分型以及多位點序列分型MLST）DNA測序。測序。常用基因分型方法的特點常用基因分型方法的特點分型方法分型方法可分型可分型菌株的菌株的比例比例重復重復性性 分辨力分辨力 解釋的解釋的容易程度容易程度 操作的操作的容易程度容易程度 質粒限制性消化質粒限制性消化 大多數大多數 好好 尚可尚可好好優(yōu)秀優(yōu)秀REA 全部全部 好好尚可尚可差差優(yōu)秀優(yōu)秀Riboty

28、ping 全部全部優(yōu)秀優(yōu)秀尚可尚可好好好好PFGE 全部全部優(yōu)秀優(yōu)秀好好優(yōu)秀優(yōu)秀好好PCR產物限制性消產物限制性消化化 全部全部優(yōu)秀優(yōu)秀尚可尚可優(yōu)秀優(yōu)秀好好基于重復序列的基于重復序列的PCR 全部全部好好尚可尚可好好好好AP-PCR（RAPD） 全部全部尚可尚可好好尚可尚可好好核酸序列分析核酸序列分析 全部全部優(yōu)秀優(yōu)秀優(yōu)秀優(yōu)秀優(yōu)秀優(yōu)秀尚可尚可注：表中的評價會因菌株的不同和技術的發(fā)展而變化注：表中的評價會因菌株的不同和技術的發(fā)展而變化RAPD分析霍亂弧菌的同源性分析霍亂弧菌的同源性M 1 2 3 4 5 6 7利用單一的任意序列的引物，隨機地擴增與靶序列完全或部分配對，利用單一的任意序列的引物，

29、隨機地擴增與靶序列完全或部分配對，以擴增出特異的以擴增出特異的DNA產物，然后進行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢產物，然后進行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，根據電泳條帶的不同，即所謂的多態(tài)性就可進行基因定位、連鎖測，根據電泳條帶的不同，即所謂的多態(tài)性就可進行基因定位、連鎖圖建立、品系圖建立、品系(種種)鑒別等方面。由于該技術具有快速靈敏，程序簡便鑒別等方面。由于該技術具有快速靈敏，程序簡便等優(yōu)點等優(yōu)點, 因此在短時間內，已廣泛應用于生物學研究領域因此在短時間內，已廣泛應用于生物學研究領域.聚類分析聚類分析凝膠成像系統(tǒng)得到凝膠成像系統(tǒng)得到RAPD圖像后，直接在其軟件中根據圖像后，直接在其軟件中根

30、據Marker及隨及隨機擴增片段在凝膠中的位置計算不同擴增片段的分子量大小，然后機擴增片段在凝膠中的位置計算不同擴增片段的分子量大小，然后采用采用SPSS統(tǒng)計軟件或其它聚類分析軟件，根據片段的分子量數據統(tǒng)計軟件或其它聚類分析軟件，根據片段的分子量數據進行聚類分析。進行聚類分析。同源性分析同源性分析M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 3425002000100075050020001000750500例一例一例二例二利用利用SPSS軟件對前軟件對

31、前2圖進行聚類分析，根據遺傳距離的差異，將圖進行聚類分析，根據遺傳距離的差異，將34株霍亂弧菌分成了株霍亂弧菌分成了2個個聚類群，每個聚類群內部菌株的遺傳距離基本相同，反映了這聚類群，每個聚類群內部菌株的遺傳距離基本相同，反映了這2組菌株的親緣關系較近。組菌株的親緣關系較近。同源性分析同源性分析0281.250100150200250Enterohaemorrhagic E.coli.SEQShigella flexneri.SEQEnterobacter aerogenes.SEQKlebsiella pneumoniae.SEQYersinia enterocolitica.SEQShig

32、ella dysenteriae.SEQSalmonella enteritidis.SEQSalmonella choleraesuis.SEQSalmonella typhimurium.SEQSalmonella typhi.SEQEnteroinvasive E.coli.SEQEnteropathogenic E.coli.SEQEnterotoxingenic E.col.SEQProteus mirabilis.SEQ0352.050100150200250300350Proteus mirabilis.SEQSalmonella typhimurium.SEQKlebsiell

33、a pneumoniae.SEQEnterotoxingenic E.coli.SEQYersinia enterocolitica.SEQSalmonella choleraesuis.SEQEnterobacter aerogenes.SEQShigella flexneri.SEQShigella dysenteriae.SEQEnteroinvasive E.coli.SEQEnteropathogenic E.coli.SEQEnterohaemorrhagic E.coli.SEQSalmonella enteritidis.SEQSalmonella typhi.SEQ核糖體基因分型核糖體基因分型Ribotyping核糖體基因分型核糖體基因分型傷寒沙門菌傷寒沙門菌16S rRNA 基因擴增片段的酶切鑒定基因擴增片段的酶切鑒定: Bca I 酶切酶切 脈沖場電泳及相關技術脈沖場電泳及相關技術脈沖場電泳脈沖場電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)通過交替改變的電場方通過交替改變的電場方向向,