環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

1、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)2015307360 吳祖雄l定義：針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60-65恒溫?cái)U(kuò)增，15-60分鐘左右即可實(shí)現(xiàn)1091010倍的核酸擴(kuò)增。擴(kuò)增目的片段時(shí)依賴的是一種具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶需四條能夠識(shí)別靶序列六個(gè)特異區(qū)域的引物L(fēng)AMP法并不需要對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行預(yù)變性及進(jìn)行溫度循環(huán)l針對(duì)靶基因的六個(gè)不同的區(qū)域，基于靶基因3 端的F3c、F2c和Flc區(qū)以及5 端的Bl、B2和B3區(qū)等6個(gè)不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì)4種引物。lLAMP反應(yīng)的開始階段四條引物都被使用，但在循環(huán)階段則只有

2、內(nèi)引物被使用。lFIP(Forward Inner Primer)：上游內(nèi)部引物，由F2區(qū)和F1C區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3端的F2c區(qū)域互補(bǔ)，F(xiàn)1C區(qū)與靶基因5端的Flc區(qū)域序列相同。lF3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)。lBIP引物：下游內(nèi)部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3端的B2c區(qū)域互補(bǔ)，B1C域與靶基因5端的Blc區(qū)域序列相同。lB3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補(bǔ)。LAMP

3、反應(yīng)引物與對(duì)應(yīng)模板區(qū)域反應(yīng)引物與對(duì)應(yīng)模板區(qū)域l第1步：內(nèi)引物FIP的F2與其模板的互補(bǔ)序列F2c結(jié)合，在Bst DNA聚合酶作用下，從F2的3末端開始啟動(dòng)DNA 合成，合成一條以FIP為起始的新的DNA單鏈，并與模板鏈結(jié)合形成新的雙鏈DNA。而原DNA雙鏈中與模板鏈互補(bǔ)的非模板鏈將被取代而游離于反應(yīng)液中。l第2步：原合成的以FIP為起始的DNA單鏈被置換而脫離，成為單鏈DNA，其在5末端F1c和F1區(qū)發(fā)生自我堿基配對(duì)，形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。l第3步：引物BIP的B2與模板鏈B2c區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，合成以BIP 為起始的新鏈，并與模板鏈互補(bǔ)形成DNA雙鏈。同時(shí)，F(xiàn)端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)將被打開，外引物B3與模板上B3

4、c雜交后，以其3末端為起點(diǎn)也開始合成新鏈，并使BIP為起始的DNA單鏈從模板鏈上脫離下來，形成以FIP和BIP為兩端的單鏈。l整條鏈呈現(xiàn)啞鈴狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)即為LAMPLAMP的的基礎(chǔ)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu). .l反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物常進(jìn)行焦磷酸鎂沉淀檢測(cè)（濁度檢測(cè)）、熒光檢測(cè)、凝膠電泳檢測(cè)、實(shí)時(shí)檢測(cè)。l濁度檢測(cè)：在LAMP反應(yīng)過程中，會(huì)產(chǎn)生一種叫焦磷酸鎂的衍生物。由于LAMP能產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物，衍生物的產(chǎn)量也會(huì)大增，于是呈現(xiàn)出白色渾濁。因此，通過觀察白色渾濁的有無，可驗(yàn)證是否有靶基因存在。l熒光檢測(cè)：鈣黃綠素（螯合劑）與試劑中的錳離子結(jié)合后處于淬滅狀態(tài)。擴(kuò)增反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸離子與錳離子結(jié)合釋放鈣黃

5、綠素，使鈣黃綠素的淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出黃綠色熒光。反應(yīng)后加熒光染料法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，在直接觀察不能準(zhǔn)確判斷結(jié)果時(shí)，加入熒光染料可增加其可視性，提高判斷的準(zhǔn)確度lLAMP克服了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要通過反復(fù)熱變性獲得單鏈模板的缺點(diǎn)，避免了反復(fù)升降溫的過程，實(shí)現(xiàn)了恒溫條件下的連續(xù)快速擴(kuò)增，具有更高的靈敏度和擴(kuò)增效率。l操作簡單：只需一個(gè)水浴鍋l快速高效：不需要預(yù)先的雙鏈DNA熱變性避免了溫度循環(huán)而造成 的時(shí)間損失l特異性強(qiáng)：針對(duì)靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的4種特異性引物。6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增。故其特異性極高。 l高靈敏度，對(duì)于病毒擴(kuò)增模板可達(dá)幾個(gè)拷貝，比PCR高出數(shù)量級(jí)的差異。l

6、缺點(diǎn)：由于LAMP擴(kuò)增是鏈置換合成，靶序列長度最好在300 bp以內(nèi)。500 bp則較難擴(kuò)增。故不能進(jìn)行長鏈DNA的擴(kuò)增。靈敏度高易造成假陽性結(jié)果。lLAMP可用于病原菌、病毒的檢測(cè)及鑒定，還可對(duì)DNA 進(jìn)行定量分析；該方法用于單核苷酸多態(tài)性分型更靈敏準(zhǔn)確，不僅能夠促進(jìn)多基因性疾病的研究，還能決定臨床藥物的使用及用藥量。目前，已建立起多種病原菌、病毒的LAMP 檢測(cè)法。l流行性乙型腦炎病毒的檢測(cè)：杜鵑等建立了流行性乙型腦炎病毒一步法RT-LAMP 檢測(cè)方法，對(duì)GenBank 中登錄的25 株JEV基因序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)該基因保守區(qū)域的RT-LAMP引物，其中包括2條外引物F3B3，2條內(nèi)引物FIPBIP和2條環(huán)引物FLPBLP。在LAMP反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA 模板，65水浴60 min，反應(yīng)可一步完成。l犬細(xì)小病毒的檢測(cè)：楊慧等建立了犬細(xì)小病毒LAMP 檢測(cè)方法，選取犬細(xì)小病