最新PCR技術的原理與方法

1、PCR技術的原理與方法PCRPCR技術的原理與方法技術的原理與方法 鐘召迪鐘召迪PCR技術的原理與方法PCR定義l 聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction)簡稱，是一項在短時間內(nèi)大量擴增特定的片段的分子生物學技術。l 是指在DNA 聚合酶的催化下，以母鏈DNA 為模板，一特定引物為延伸起點，經(jīng)過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出于母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。l 可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達調(diào)控，基因多態(tài)性研究等。PCR技術的原理與方法PCR反應特點l特異性強l靈敏度高l簡便、快速l對標本的純度要求低PCR技術的原理與方法PCR技術的基本原理lPCR

2、的反應成分lPCR的反應基本步驟lPCR的反應體系PCR技術的原理與方法PCR的反應成分l模板DNA l引物l四種脫氧核糖核苷酸lDNA聚合酶l反應緩沖液，Mg2PCR技術的原理與方法PCR的反應基本步驟lPCR的反應基本步驟l變性：高溫使雙鏈DNA解離成單鏈（94 ，30s）l退火：低溫下，引物與DNA模板互補區(qū)結合（55 ， 30s ）l延伸：中溫延伸，DNA聚合酶催化以引物為起點的DNA鏈延伸反應（7072 ，3060s）PCR技術的原理與方法PCR技術的原理與方法PCR的反應體系 10擴增緩沖液 1/10體積 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 (2個) 0.2umol/L

3、 模板DNA 102 105 Taq DNA聚合酶 1 2.5單位/反應體系 Mg2+ 1.52.5mmol/L 加雙或三蒸水至 25 50ulPCR技術的原理與方法PCR反應五要素l引物（primer）l 酶 （Taq DNA polymerase） l dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） l模板 （template） lMg2+ （magnesium）PCR技術的原理與方法引物l引物是PCR特異性反應的關鍵lPCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度l理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，用 PCR就可將模板DNA在體外大量

4、擴增PCR技術的原理與方法引物設計的原則l引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設計l引物長度一般在1530堿基之間l引物GC含量在40%60%之間，Tm值最好接近72l引物3端要避開密碼子的第3位l引物3端不能選擇A，最好選擇Tl堿基要隨機分布l引物自身及引物之間不應存在互補序列PCR技術的原理與方法引物設計的原則l引物5 端和中間G值應該相對較高，而3 端G值較低l引物的5端可以修飾，而3端不可修飾l擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結構l引物應具有特異性PCR技術的原理與方法酶及其濃度l目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應 天然酶：從棲熱水生桿菌中提純 基因工程酶：大腸菌合成l一個典型的 PCR反應

5、約需酶量 2.5U（指總反應體積為100 ul時）l濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少PCR技術的原理與方法DNTP 的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴增效率有密切關系dNTP呈顆粒狀， 保存不當易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解在PCR反應中，dNTP應為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制 ）， 如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的

6、產(chǎn)量dNTP 能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低PCR技術的原理與方法模板（靶基因，TARGET GENE）l模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一l傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K 來消化處理標本SDS 的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結合而沉淀蛋白酶K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結合的組蛋白, 再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸PCR技術的原理與方法MG2+濃度lMg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響l在一般的 PCR反應中，

7、各種NTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.52.0 mmol/L為宜lMg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增， 濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少PCR技術的原理與方法PCR反應條件的選擇 PCR反應條件: : 溫度 時間 循環(huán)次數(shù)PCR技術的原理與方法溫度與時間的設置l設置變性-退火-延伸三個溫度點l標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至40 60，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸l對于較短靶基因（長度為100300bp時）可采用二溫度點法， 將退火

8、與延伸溫度合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸PCR技術的原理與方法變性溫度與時間l變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因l一般9394lmin足以使模板DNA變性 若低于93則需延長時間 但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。l此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導致PCR失敗PCR技術的原理與方法退火(復性)溫度與時間l退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素l變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞l退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度l對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點較為理想PCR技術的原理與方法延伸溫度與時間l延伸溫度：一般選擇在7075之間 常用溫度為72 過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。l延伸反應時間：根據(jù)待擴增片段長度而定 1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min（足夠） 34kb的靶序列需34min 擴增10Kb需延伸至15m