第1章蛋白質(zhì)多肽

1、 多肽和蛋白質(zhì)多肽和蛋白質(zhì) 第第 一一 章章 從基因到蛋白質(zhì)從基因到蛋白質(zhì) 本章內(nèi)容本章內(nèi)容一一蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識二二多肽的化學(xué)生物學(xué)多肽的化學(xué)生物學(xué)三三蛋白質(zhì)化學(xué)合成蛋白質(zhì)化學(xué)合成四四蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)藥物蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)藥物一、什么是蛋白質(zhì)一、什么是蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵通過肽鍵(peptide bond)相連形成的高相連形成的高分子含氮化合物。分子含氮化合物。1. 蛋白質(zhì)是生物蛋白質(zhì)是生物 體重要組成成分體重要組成成分分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個

2、部分都含有蛋白質(zhì)。細(xì)胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)最豐富的有機分含量高：蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的子，占人體干重的45，某些組織含量更高，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達(dá)例如脾、肺及橫紋肌等高達(dá)80。1 1）作為生物催化劑（酶）作為生物催化劑（酶）2 2）代謝調(diào)節(jié)作用）代謝調(diào)節(jié)作用3 3）免疫保護作用）免疫保護作用4 4）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲5 5）運動與支持作用）運動與支持作用6 6）參與細(xì)胞間信息傳遞）參與細(xì)胞間信息傳遞多肽和蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識多肽和蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識第第 一一 節(jié)節(jié) 組成蛋白質(zhì)的元素組成蛋白質(zhì)的元素主要有主要有C、H、O

3、、N和和S。 有些蛋白質(zhì)含有少量有些蛋白質(zhì)含有少量磷磷或金屬元素或金屬元素鐵、鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質(zhì)還含有，個別蛋白質(zhì)還含有碘碘 。 蛋蛋 白白 質(zhì)質(zhì) 的的 分分 子子 組組 成成1 1 氨氨基酸基酸 組成蛋白質(zhì)的基本單位組成蛋白質(zhì)的基本單位存在自然界中的氨基酸有存在自然界中的氨基酸有300余種，但余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均種，且均屬屬 L-氨基酸氨基酸（甘氨酸除外）。（甘氨酸除外）。L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式RC+NH3COO-H1. 非極性疏水性氨基酸非極性疏水性氨基酸2. 極性中性氨基酸極性中性氨基酸3.

4、酸性氨基酸酸性氨基酸4. 堿性氨基酸堿性氨基酸（一）氨基酸的分類（一）氨基酸的分類* * 2020種氨基酸的英文名稱、縮寫符號及分類如下種氨基酸的英文名稱、縮寫符號及分類如下: :甘氨酸甘氨酸 glycine Gly G 5.97丙氨酸丙氨酸 alanine Ala A 6.00纈氨酸纈氨酸 valine Val V 5.96亮氨酸亮氨酸 leucine Leu L 5.98 異亮氨酸異亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48脯氨酸脯氨酸 proline Pro P 6.301. 非極性疏水性氨基酸非極性疏水性氨基酸

5、色氨酸色氨酸 tryptophan Try W 5.89絲氨酸絲氨酸 serine Ser S 5.68酪氨酸酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 蘇氨酸蘇氨酸 threonine Thr T 5.602. 極性中性氨基酸極性中性氨基酸天冬氨酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸谷氨酸 glutamic acid Glu E

6、 3.22賴氨酸賴氨酸 lysine Lys K 9.74精氨酸精氨酸 arginine Arg R 10.76組氨酸組氨酸 histidine His H 7.593. 酸性氨基酸酸性氨基酸4. 堿性氨基酸堿性氨基酸幾種特殊氨基酸幾種特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸（亞氨基酸）（亞氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫鍵二硫鍵-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-

7、CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3二硫鍵與蛋白質(zhì)折疊二硫鍵與蛋白質(zhì)折疊（二）氨基酸的理化性質(zhì)（二）氨基酸的理化性質(zhì)1. 兩性解離及等電點兩性解離及等電點等電點等電點(isoelectric point, pI) 在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解離成的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值值稱為該氨基酸的稱為該氨基酸的等電點等電點。pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性離子氨基酸的兼性離子 陽

8、離子陽離子陰離子陰離子CHNH2COOHR CHNH2COOHRCHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH COOHRNH3+CH COOHRNH3+色氨酸、酪氨酸色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在的最大吸收峰在 280 nm 附近。附近。大多數(shù)蛋白質(zhì)含大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法的快速簡便的方法。1mg/ml芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收 肽鍵肽鍵(peptide bond)是由一個氨

9、基酸是由一個氨基酸的的 -羧基與另一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的 -氨基脫水氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵?？s合而形成的化學(xué)鍵。NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽鍵NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO* * 肽是由氨基酸通過肽是由氨基酸通過肽鍵肽鍵縮合而形成的化縮合而形成的化合物。合物。* * 兩分子氨基酸縮合形成兩分子氨基酸縮合形成二肽二肽，三分子氨，三分子氨基酸縮合則形成基酸縮合則形成三肽三肽* * 肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮

10、合而基團不肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為全，被稱為氨基酸殘基氨基酸殘基(residue)。* * 由由1515個個以內(nèi)以內(nèi)氨基酸氨基酸相連而相連而成成的的肽肽稱為寡肽稱為寡肽(oligopeptide)，的肽稱多肽的肽稱多肽(polypeptide)。N 末端：多肽鏈中有末端：多肽鏈中有自由氨基自由氨基的一端的一端C 末端：多肽鏈中有末端：多肽鏈中有自由羧基自由羧基的一端的一端多肽鏈有兩端多肽鏈有兩端* 多肽鏈多肽鏈(polypeptide chain)是指許多氨基是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核

11、糖核酸酶豌豆豌豆 defensin 1 三維結(jié)構(gòu)三維結(jié)構(gòu)NC常用的蛋白質(zhì)信息網(wǎng)站常用的蛋白質(zhì)信息網(wǎng)站Expert Protein Analysis Systemhttp:/www.expasy.ch/Protein Data Bank l/l 體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽 神經(jīng)肽神經(jīng)肽(neuropeptide)（二）（二） 幾種生物活性肽幾種生物活性肽單純蛋白質(zhì)單純蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì) = = 蛋白質(zhì)部分蛋白質(zhì)部分 + + 非蛋白質(zhì)部分非蛋白質(zhì)部分纖維狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)球狀蛋白質(zhì)球狀蛋白質(zhì) 肽

12、的分類肽的分類 一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)(primary structure)二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)三級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)四級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)(quaternary structure)高級高級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)3.1 3.1 蛋蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)主要的化學(xué)鍵主要的化學(xué)鍵一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。功能的基礎(chǔ)。3.2 蛋蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)定義定義 主要的化學(xué)鍵主要的化學(xué)鍵： 氫鍵氫鍵 （二）（二） - -螺旋螺旋目目 錄錄（三）（三） - -折疊折疊鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣

13、離子的模體鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體 - Beta Helices 3.3 蛋蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)疏水鍵、離子鍵、氫鍵和疏水鍵、離子鍵、氫鍵和 Van der Waals力等。力等。 主要的化學(xué)鍵主要的化學(xué)鍵整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置位置,即即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。（一）（一） 定義定義 N 端端 C端端亞基之間的結(jié)合力主要是亞基之間的結(jié)合力主要是，其次，其次是氫鍵和離子鍵。是氫鍵和離子鍵。有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級

14、結(jié)構(gòu)，稱為蛋白每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的質(zhì)的亞基亞基 (subunit)。 一級一級 二級二級 三級三級 四級四級 卷曲螺旋卷曲螺旋(coiled coil)（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ) 3.5 蛋蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu) 天然狀態(tài)，天然狀態(tài)，有催化活性有催化活性 非折疊狀態(tài)，無活性非折疊狀態(tài)，無活性 N-val his leu thr pro glu glu C(146) HbS 肽鏈肽鏈HbA 肽肽 鏈鏈N-val his leu thr pro val glu C(1

15、46) Hb與與Mb一樣能可逆地與一樣能可逆地與O2結(jié)合，結(jié)合， Hb與與O2結(jié)合后稱為結(jié)合后稱為氧合氧合Hb。氧合。氧合Hb占總占總Hb的百的百分?jǐn)?shù)（分?jǐn)?shù)（稱百分飽和度稱百分飽和度）隨）隨O2濃度變化而改變。濃度變化而改變。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折疊折疊正常正常瘋牛病瘋牛病4 蛋蛋白質(zhì)的分離和純化白質(zhì)的分離和純化（一）透析及超濾法（一）透析及超濾法* * * （二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀（二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀 *使用丙酮沉淀時，必須在使用丙酮沉淀時，必須在04低溫下進(jìn)行，低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，

16、應(yīng)立即分離。除了丙酮以質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。 *鹽析鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。沉淀。 * * 免疫沉淀法：免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白

17、質(zhì)混合溶液中分復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。離獲得抗原蛋白。 （三）電泳（三）電泳根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。膠電泳等。 *pI層析層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理分離蛋白質(zhì)的原理* * （五）超速離心（五）超速離心* * 5 多多肽鏈中氨基酸序列分析肽鏈中氨基酸序列分析分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析測定各肽段的氨基

18、酸排列順序，一般采用測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。基酸順序的結(jié)果。異硫氰酸苯酯異硫氰酸苯酯 二二級結(jié)構(gòu)測定級結(jié)構(gòu)測定通常采用圓二色光譜通常采用圓二色光譜(circular dichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。 -螺旋的螺旋的CD峰峰有有222 nm處的負(fù)峰、處的負(fù)峰、208nm處的處的負(fù)峰和負(fù)峰和198 nm

19、處的正峰三個成分；而處的正峰三個成分；而 -折疊的折疊的CD譜不很固定。譜不很固定。 X射線衍射法射線衍射法(X-ray diffraction)核核磁共振技術(shù)磁共振技術(shù)(NMR) 多肽的化學(xué)生物學(xué)多肽的化學(xué)生物學(xué)第第 二二 節(jié)節(jié)l多肽的化學(xué)生物學(xué)多肽的化學(xué)生物學(xué)l蛋白質(zhì)化學(xué)合成蛋白質(zhì)化學(xué)合成l蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)藥物蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)藥物2.1 多肽的化學(xué)合成多肽的化學(xué)合成1. 肽鍵形成原理和保護基肽鍵形成原理和保護基 氨基酸的活性基團必須進(jìn)行保護。氨基酸的活性基團必須進(jìn)行保護。 肽鍵形成步驟肽鍵形成步驟R1PGOHOH2NR1OHONH活化活化PGR1NH OXR2OHOH2NPGNHR1O

20、HNR2OHO2. 化學(xué)合成多肽的發(fā)展歷程化學(xué)合成多肽的發(fā)展歷程l早期：液相合成早期：液相合成 1901，德國化學(xué)家，德國化學(xué)家Fischer合成了合成了Gly-Gly 20世紀(jì)中期，合成活性肽，如催產(chǎn)素、胰島素。世紀(jì)中期，合成活性肽，如催產(chǎn)素、胰島素。 1963年，年，Merrifield提出了固相合成（提出了固相合成（SPPS），），1984年諾貝爾獎。在年諾貝爾獎。在1966年發(fā)明了第一臺自動的年發(fā)明了第一臺自動的固相肽合成儀。固相肽合成儀。 3. 液相多肽合成液相多肽合成步步 4. 固相多肽合成固相多肽合成NHOROHYNHOROY去保護去保護H2NORONHOR2OHYR2ONHHN

21、YORO 固相多肽合成過程固相多肽合成過程根據(jù)保護策略不同分為根據(jù)保護策略不同分為Boc和和Fmoc方法方法Boc叔丁氧羰基叔丁氧羰基 30%-50%30%-50%三氟乙酸三氟乙酸 強酸強酸 很少應(yīng)用很少應(yīng)用 Fmoc9-芴甲氧羰基芴甲氧羰基 20%哌啶哌啶 弱酸弱酸 方便方便 類型類型 脫除保護基條件脫除保護基條件 裂解條件裂解條件 自動化合成自動化合成l環(huán)合方式：環(huán)合方式： 主鏈頭主鏈頭- -尾環(huán)合，側(cè)鏈尾環(huán)合，側(cè)鏈- -側(cè)鏈環(huán)合側(cè)鏈環(huán)合 側(cè)鏈側(cè)鏈- -頭環(huán)合，尾頭環(huán)合，尾- -側(cè)鏈環(huán)合側(cè)鏈環(huán)合 固相液相方法均可，但反應(yīng)較慢。固相液相方法均可，但反應(yīng)較慢。 5. 環(huán)肽合成環(huán)肽合成2.2 肽

22、模擬物肽模擬物1.以酰胺類似物或二級結(jié)構(gòu)類似物代替多肽的模擬物。以酰胺類似物或二級結(jié)構(gòu)類似物代替多肽的模擬物。 e.g. NH 用氧原子（用氧原子（ O ），硫原子（），硫原子（ S ），取代），取代或是對其進(jìn)行烷基化修飾?；蚴菍ζ溥M(jìn)行烷基化修飾。 2. 功能模擬物：作用于多肽受體的非肽類小分子，是天然功能模擬物：作用于多肽受體的非肽類小分子，是天然多肽的結(jié)構(gòu)類似物。多肽的結(jié)構(gòu)類似物。3. 非肽類化合物：有新型的肽母核，但包含多肽發(fā)揮作用非肽類化合物：有新型的肽母核，但包含多肽發(fā)揮作用所必須的關(guān)鍵功能基團。所必須的關(guān)鍵功能基團。 類肽類肽l定義：以定義：以N-取代甘氨酸為構(gòu)建的單元化合物。取代

23、甘氨酸為構(gòu)建的單元化合物。 優(yōu)點：比肽的構(gòu)象柔性高，不會被蛋白酶水優(yōu)點：比肽的構(gòu)象柔性高，不會被蛋白酶水解，具有更高的代謝穩(wěn)定性，提高生物利用度及解，具有更高的代謝穩(wěn)定性，提高生物利用度及生物活性生物活性 。R3OHNOR2R1HNO肽肽類肽類肽NHONR1NR2ONR32.4 多肽的應(yīng)用和肽類藥物多肽的應(yīng)用和肽類藥物多肽多肽+優(yōu)點：比藥物更容易在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可用于預(yù)測藥物作優(yōu)點：比藥物更容易在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可用于預(yù)測藥物作 用位點，確認(rèn)靶標(biāo)。用位點，確認(rèn)靶標(biāo)。 2.2 2.2.1 1. 發(fā)展歷程發(fā)展歷程 固相多肽合成實踐中指能合成固相多肽合成實踐中指能合成50-60個氨基酸個氨基酸的肽鏈。的肽

24、鏈。連接反應(yīng)連接反應(yīng)Target Protein 多肽的側(cè)鏈官能團需要保護。多肽的側(cè)鏈官能團需要保護。 局限局限 2. 自然化學(xué)連接自然化學(xué)連接(Native chemical ligation, NCL)反應(yīng)機理反應(yīng)機理多肽硫酯是制備的關(guān)鍵，限制是多肽硫酯是制備的關(guān)鍵，限制是Cys Boc法制備硫酯法制備硫酯l目前最有效方法；目前最有效方法；l但產(chǎn)率低，反應(yīng)條件劇烈，危險。但產(chǎn)率低，反應(yīng)條件劇烈，危險。3. NCL的應(yīng)用和實例的應(yīng)用和實例lHIV1蛋白酶的合成蛋白酶的合成 抗抗HIV療法的一個靶向目標(biāo)，由療法的一個靶向目標(biāo)，由2條含條含99的氨基酸的多的氨基酸的多肽組成的聚體。肽組成的聚體。

25、 HIV1蛋白酶是病毒復(fù)制必需酶蛋白酶是病毒復(fù)制必需酶 HIV1蛋白酶的合成過程蛋白酶的合成過程A1-A40B42-B99A42-A99B1-b40A1-A40A42-A99B1-b40B42-B99A1-A40A42-A99B1-b40B42-B99GlnA41Gln-(Gly)4GlnB41CysA41CysB41GlnA41arylSarylSarylSarylSGlnB41+Cys-(Gly)4Cys-(Gly)4 生物學(xué)的方法生物學(xué)的方法 內(nèi)含肽內(nèi)含肽 1. 發(fā)展歷程發(fā)展歷程1）蛋白質(zhì)半合成的提出蛋白質(zhì)半合成的提出天然蛋白天然蛋白 水解切斷水解切斷 片段片段 合成蛋白質(zhì)合成蛋白質(zhì)2）

26、化學(xué)性連接方法：）化學(xué)性連接方法：Kent ，解決了保護的問題，需要引入，解決了保護的問題，需要引入N端端Cys 或或C端硫酯，重組蛋白制備問題。端硫酯，重組蛋白制備問題。3）蛋白質(zhì)剪接技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用）蛋白質(zhì)剪接技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用內(nèi)含肽（內(nèi)含肽（Intein）是一段隨功能蛋白一）是一段隨功能蛋白一起表達(dá)，并在表達(dá)后可進(jìn)行自剪接的多起表達(dá)，并在表達(dá)后可進(jìn)行自剪接的多肽。它兼有蛋白酶和蛋白連接酶的特性，肽。它兼有蛋白酶和蛋白連接酶的特性，與內(nèi)含子（與內(nèi)含子（RNA水平自剪切）的作用方水平自剪切）的作用方式類似。式類似。 什么是內(nèi)含肽？什么是內(nèi)含肽？ 1994年年perler報道了第一個存在報道了第

27、一個存在于啤酒酵母于啤酒酵母VAM1基因的基因的內(nèi)含肽內(nèi)含肽后，后，已鑒定出已鑒定出400多種多種蛋白質(zhì)剪接過程蛋白質(zhì)剪接過程 第第1步：剪接是由步：剪接是由N末端的半胱氨酸的末端的半胱氨酸的N S或是或是N-O的酰的?；w移，將基遷移，將N端外顯肽端外顯肽1連接到內(nèi)含肽連接到內(nèi)含肽N端端Cys的巰基上形的巰基上形成硫酯；成硫酯； 第第2步：發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)：外顯肽步：發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)：外顯肽2的的N端半胱氨酸殘基巰端半胱氨酸殘基巰基攻擊硫酯，形成一個分支狀的酯或硫酯中間物；基攻擊硫酯，形成一個分支狀的酯或硫酯中間物； 第第3步：是肽鍵的斷裂伴隨著內(nèi)含肽步：是肽鍵的斷裂伴隨著內(nèi)含肽C末端琥珀酰胺的

28、形成，末端琥珀酰胺的形成，使內(nèi)含肽釋放出來。接著放生使內(nèi)含肽釋放出來。接著放生S N或或S-O?；D(zhuǎn)移，形成?；D(zhuǎn)移，形成一個穩(wěn)定的酰胺鍵，從而形成一個成熟的外顯肽。一個穩(wěn)定的酰胺鍵，從而形成一個成熟的外顯肽。 蛋白質(zhì)剪接機理蛋白質(zhì)剪接機理1: ?；D(zhuǎn)移?；D(zhuǎn)移3: 琥珀酰胺中間體琥珀酰胺中間體Chong et al. (1996) J. Biol Chem. 271:22159內(nèi)含肽內(nèi)含肽外顯肽外顯肽2外顯肽外顯肽1亞酰胺亞酰胺內(nèi)含肽的應(yīng)用內(nèi)含肽的應(yīng)用生產(chǎn)環(huán)肽和蛋白生產(chǎn)環(huán)肽和蛋白蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化位點特異性蛋白修飾位點特異性蛋白修飾分子間蛋白質(zhì)互作分子間蛋白質(zhì)互作蛋白連接蛋白連接（IPL）

29、2. 2. 表達(dá)蛋白連接（表達(dá)蛋白連接（EPL)EPL)l始于始于1998年，利用蛋白質(zhì)剪接技術(shù)。年，利用蛋白質(zhì)剪接技術(shù)。l硫酯是硫酯是NCL和和EPL的活性關(guān)鍵基團的活性關(guān)鍵基團,蛋白硫酯通過蛋白硫酯通過重組表達(dá)獲得。重組表達(dá)獲得。l利用蛋白剪接制備硫酯。利用蛋白剪接制備硫酯。HSHN蛋白剪接制備硫酯蛋白剪接制備硫酯NHO多肽多肽內(nèi)含肽內(nèi)含肽CBDOSO多肽多肽H2N內(nèi)含肽內(nèi)含肽HNCBDORSHSRO多肽多肽硫酯硫酯HSH2N內(nèi)含肽內(nèi)含肽HNCBDOHNHSHN表達(dá)蛋白連接示意圖表達(dá)蛋白連接示意圖NHO多肽多肽1內(nèi)含肽內(nèi)含肽CBDOSO多肽多肽1H2N內(nèi)含肽內(nèi)含肽HNCBDORSHO多肽多

30、肽1SRO多肽多肽1HS多肽多肽2HSNH2多肽多肽2NCL3. EPL的應(yīng)用實例的應(yīng)用實例（1 1） 蛋白質(zhì)翻譯后修飾蛋白質(zhì)翻譯后修飾 例子：例子：Muir利用利用EPL用于泛素化組蛋白用于泛素化組蛋白H2B的合成的合成H2B(118-125)泛素泛素(1-75)OSRH2B(118-125)泛素泛素(1-75)H2B(1-116)H2B(1-116)H2B(118-125)泛素泛素(1-75)脫硫脫硫(2) (2) 引入非天然氨基酸引入非天然氨基酸 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能 （4） 蛋白質(zhì)固定化用于生物芯片研究蛋白質(zhì)固定化用于生物芯片研究 幾種蛋白純化方法幾種蛋白純化方法Intein

31、System（5） 內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)純化內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)純化 C 端融合端融合 N 端融合端融合 優(yōu)點優(yōu)點l使用親和層析的方法得到無親和標(biāo)簽的蛋白，使用親和層析的方法得到無親和標(biāo)簽的蛋白， 避免使用昂貴的蛋白酶切除親和標(biāo)簽；避免使用昂貴的蛋白酶切除親和標(biāo)簽；l可得到無甲硫氨酸和載體氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。可得到無甲硫氨酸和載體氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。TRENDS in Biochemical Sciences Vol.27 No.3 2002 7070年代年代GranGran首首先在一種非洲植物先在一種非洲植物發(fā)現(xiàn)一種由發(fā)現(xiàn)一種由2929個氨個氨基酸的環(huán)肽基酸的環(huán)肽Kalata Kalata B1

32、B1后，人們相繼從后，人們相繼從微生物、動植物中微生物、動植物中發(fā)現(xiàn)了環(huán)形的肽和發(fā)現(xiàn)了環(huán)形的肽和蛋白。蛋白。 環(huán)化環(huán)化聚合聚合目的蛋白目的蛋白N-內(nèi)含肽內(nèi)含肽 C-內(nèi)含肽內(nèi)含肽 2.3 蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)藥物蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)藥物.1 蛋白質(zhì)修飾蛋白質(zhì)修飾 定義：通過化學(xué)手段改變蛋白質(zhì)分子的化學(xué)定義：通過化學(xué)手段改變蛋白質(zhì)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而在目標(biāo)蛋白上引入特定的化學(xué)基團，結(jié)構(gòu)，從而在目標(biāo)蛋白上引入特定的化學(xué)基團，改變其化學(xué)功能和生物性質(zhì)，以便研究蛋白質(zhì)的改變其化學(xué)功能和生物性質(zhì)，以便研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，并定向的改造蛋白質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，并定向的改造蛋白質(zhì)的性質(zhì)

33、和功能。功能。 類型類型： （1 1）基于天然氨基酸側(cè)鏈官能團的修飾）基于天然氨基酸側(cè)鏈官能團的修飾l酪氨酸、賴氨酸、色氨酸、半胱氨酸、組氨酸酪氨酸、賴氨酸、色氨酸、半胱氨酸、組氨酸lN端位點的選擇性修飾端位點的選擇性修飾lC端位點的選擇性修飾端位點的選擇性修飾l特殊序列的蛋白質(zhì)修飾特殊序列的蛋白質(zhì)修飾 特殊序列的蛋白質(zhì)修飾Cys CysCys CysPro GlySHSHSHSHCO2HOHOOAsAsSSSSCO2HOHOOAsAsSSSSCCPGCC序列序列雙砷熒光染料雙砷熒光染料 （2 2）基于非天然活性基團的正交方法）基于非天然活性基團的正交方法l酮基官能化修飾：酮基酮基官能化修飾：

34、酮基+烷氧基烷氧基 腙或胯腙或胯lStaudinger連接修飾：疊氮化合物和三苯基磷化合物作用連接修飾：疊氮化合物和三苯基磷化合物作用生成酰胺鍵，反應(yīng)中脫去一份子氮氣形成磷的亞氨基化合生成酰胺鍵，反應(yīng)中脫去一份子氮氣形成磷的亞氨基化合物。物。lClick反應(yīng)修飾：疊氮和炔發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)。反應(yīng)修飾：疊氮和炔發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)。腙腙蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)N3NH染料染料OCu離子離子+蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)染料染料 。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)N3生物素生物素+糖復(fù)合物糖復(fù)合物蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)生物素生物素糖復(fù)合物糖復(fù)合物.2 蛋白質(zhì)藥物蛋白質(zhì)藥物 疾病疾病 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 目前應(yīng)用心臟病、糖尿病、自身免疫病等很多方面目前應(yīng)

35、用心臟病、糖尿病、自身免疫病等很多方面。l蛋白質(zhì)藥物可分為多肽和基因工程藥物、單克隆蛋白質(zhì)藥物可分為多肽和基因工程藥物、單克隆抗體和基因工程抗體、重組疫苗。抗體和基因工程抗體、重組疫苗。 19821982年美國年美國LikkyLikky公司首先將重組胰島素投放市公司首先將重組胰島素投放市場，標(biāo)志著第一個重組蛋白質(zhì)藥物的誕生。場，標(biāo)志著第一個重組蛋白質(zhì)藥物的誕生。 A. 生物體內(nèi)分離生物體內(nèi)分離:主要是動物組織、天然微生物、主要是動物組織、天然微生物、植物。植物。 B. 重組重組DNA技術(shù)、分子克隆技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)，技術(shù)、分子克隆技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)，在細(xì)菌、哺乳動物等培養(yǎng)細(xì)胞中得到。在細(xì)菌、哺

36、乳動物等培養(yǎng)細(xì)胞中得到。 缺點：分離步驟困難，純度不高。缺點：分離步驟困難，純度不高。 優(yōu)點：容易分離優(yōu)點：容易分離. .（1 1）蛋白質(zhì)藥物的來源）蛋白質(zhì)藥物的來源 乳腺生物反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器 動物：綿羊、山羊、豬、牛動物：綿羊、山羊、豬、牛技術(shù)水平已經(jīng)達(dá)商業(yè)化生產(chǎn)要技術(shù)水平已經(jīng)達(dá)商業(yè)化生產(chǎn)要求的有約求的有約3030種以上種以上正在進(jìn)行臨床試驗的有約正在進(jìn)行臨床試驗的有約15-2015-20種。種。約約120120種以上的藥用蛋白正在進(jìn)種以上的藥用蛋白正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的開發(fā)行轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的開發(fā)利用動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)點利用動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)點 生物活性高，無