乳制品中微生物的檢測(cè)

1、組員： 邵顧 薛蓉雅許華劉孟晨乳酸菌簡(jiǎn)介抗生素簡(jiǎn)介乳酸菌的檢驗(yàn)抗生素殘留量的檢驗(yàn)1、代謝類型：異養(yǎng)厭氧型2、生物類型：原核生物細(xì)菌 乳酸菌乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱。 凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌。這是一群相當(dāng)龐雜的細(xì)菌，目前至少可分為18個(gè)屬，共有200多種。除極少數(shù)外，其中絕大部分都是人體內(nèi)必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中。目前已被國(guó)內(nèi)外生物學(xué)家所證實(shí)，腸內(nèi)乳酸菌與健康長(zhǎng)壽有著非常密切的直接關(guān)系。 生理功能生理功能1防治有些人種普遍患有的乳糖不耐癥（喝鮮奶時(shí)出現(xiàn)的腹脹、腹瀉等癥狀）。 2促進(jìn)

2、蛋白質(zhì)、單糖及鈣、鎂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，產(chǎn)生維生素B族等大量有益物質(zhì)。 3使腸道菌群的構(gòu)成發(fā)生有益變化，改善人體胃腸道功能，恢復(fù)人體腸道內(nèi)菌群平衡，形成抗菌生物屏障，維護(hù)人體健康。 4、抑制腐敗菌的繁殖，消解腐敗菌產(chǎn)生的毒素，清除腸道垃圾。 5抑制膽固醇吸收，降血脂、降血壓作用。 6免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)人體免疫力和抵抗力。 7抗腫瘤、預(yù)防癌癥作用。 8提高SOD酶活力，消除人體自由基，具抗衰老、延年益壽作用。 作用。 抗生素（antibiotics）是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。

3、現(xiàn)臨床常用的抗生素有微生物培養(yǎng)液液中提取物以及用化學(xué)方法合成或半合成的化合物。目前已知天然抗生素不下萬(wàn)種?？股匾郧氨环Q為抗菌素，事實(shí)上它不僅能殺滅細(xì)菌而且對(duì)霉菌、支原體、衣原體等其它致病微生物也有良好的抑制和殺滅作用，近年來(lái)通常將抗菌素改稱為抗生素?？股乜梢允悄承┪⑸锷L(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的一種物質(zhì)，用于治病的抗生素除由此直接提取外；還有完全用人工合成或部分人工合成的。通俗地講，抗生素就是用于治療各種細(xì)菌感染或抑制致病微生物感染的藥物。 但是過(guò)量使用會(huì)抑制體內(nèi)的有益菌，使腸道菌群失衡。導(dǎo)致疾病的引起。 抗生素等抗菌劑的抑菌或殺菌作用，主要是針對(duì)“細(xì)菌有而人（或其它高等動(dòng)植物）沒有”的機(jī)制進(jìn)行

4、殺傷，有5大類作用機(jī)理： 阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致細(xì)菌在低滲透壓環(huán)境下膨脹破裂死亡，以這種方式作用的抗生素主要是-內(nèi)酰胺類抗生素。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，不受這類藥物的影響。 與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性、打開膜上的離子通道，讓細(xì)菌內(nèi)部的有用物質(zhì)漏出菌體或電解質(zhì)平衡失調(diào)而死。以這種方式作用的抗生素有多粘菌素和短桿菌肽等。 與細(xì)菌核糖體或其反應(yīng)底物（如tRNA、mRNA）相互所用，抑制蛋白質(zhì)的合成這意味著細(xì)胞存活所必需的結(jié)構(gòu)蛋白和酶不能被合成。以這種方式作用的抗生素包括四環(huán)素類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、氨基糖苷類抗生素、氯霉素等。 阻礙細(xì)菌DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，阻礙DNA復(fù)制將

5、導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞分裂繁殖受阻，阻礙DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA則導(dǎo)致后續(xù)的mRNA翻譯合成蛋白的過(guò)程受阻。以這種方式作用的主要是人工合成的抗菌劑喹諾酮類（如氧氟沙星）。 影響葉酸代謝 抑制細(xì)菌葉酸代謝過(guò)程中的二氫葉酸合成酶和二氫葉酸還原酶，妨礙葉酸代謝。因?yàn)槿~酸是合成核酸的前體物質(zhì)，葉酸缺乏導(dǎo)致核酸合成受阻，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，主要是磺胺類和甲氧芐啶。1877年，年，Pasteur和和Joubert首先認(rèn)識(shí)到微生物產(chǎn)品首先認(rèn)識(shí)到微生物產(chǎn)品有可能成為治療藥物，他們發(fā)表了實(shí)驗(yàn)觀察，即普有可能成為治療藥物，他們發(fā)表了實(shí)驗(yàn)觀察，即普通的微生物能抑制尿中炭疽桿菌的生長(zhǎng)。通的微生物能抑制尿中炭疽桿菌的生長(zhǎng)。1928

6、年，弗萊明爵士發(fā)現(xiàn)了能殺死致命的細(xì)菌年，弗萊明爵士發(fā)現(xiàn)了能殺死致命的細(xì)菌的青霉菌。青霉素治愈了的青霉菌。青霉素治愈了梅毒梅毒和和淋病淋病，而且在當(dāng)時(shí)，而且在當(dāng)時(shí)沒有任何明顯的副作用。沒有任何明顯的副作用。1936年，磺胺的臨床應(yīng)用開創(chuàng)了現(xiàn)代抗微生物年，磺胺的臨床應(yīng)用開創(chuàng)了現(xiàn)代抗微生物化療的新紀(jì)元?；煹男录o(jì)元。1944年在新澤西大學(xué)分離出來(lái)第二種抗生素鏈年在新澤西大學(xué)分離出來(lái)第二種抗生素鏈霉素，它有效治愈了另一種可怕的傳染?。航Y(jié)核。霉素，它有效治愈了另一種可怕的傳染?。航Y(jié)核。1947年出現(xiàn)氯霉素，它主要針對(duì)痢疾、炭疽病年出現(xiàn)氯霉素，它主要針對(duì)痢疾、炭疽病菌，治療輕度感染。菌，治療輕度感染。19

7、48年四環(huán)素出現(xiàn)，這是最早的廣譜抗生素。在當(dāng)時(shí)年四環(huán)素出現(xiàn)，這是最早的廣譜抗生素。在當(dāng)時(shí)看來(lái)，它能夠在還未確診的情況下有效地使用。今天看來(lái)，它能夠在還未確診的情況下有效地使用。今天四環(huán)素基本上只被用于家畜飼養(yǎng)。四環(huán)素基本上只被用于家畜飼養(yǎng)。 1956年禮來(lái)公司發(fā)明了萬(wàn)古霉素被稱為抗生素的年禮來(lái)公司發(fā)明了萬(wàn)古霉素被稱為抗生素的最后武器。因?yàn)樗鼘?duì)最后武器。因?yàn)樗鼘?duì)G+細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和RNA有有三重殺菌機(jī)制，不易誘導(dǎo)細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥。三重殺菌機(jī)制，不易誘導(dǎo)細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥。 1980年代喹諾酮類藥物出現(xiàn)。和其他抗菌藥不同，年代喹諾酮類藥物出現(xiàn)。和其他抗菌藥不同，它們破壞細(xì)菌染

8、色體，不受基因交換耐藥性的影響。它們破壞細(xì)菌染色體，不受基因交換耐藥性的影響。 1992年，這類藥物中的一個(gè)變體因?yàn)樵斐筛文I功年，這類藥物中的一個(gè)變體因?yàn)樵斐筛文I功能紊亂被美國(guó)取締，但在發(fā)展中國(guó)家仍有使用。能紊亂被美國(guó)取締，但在發(fā)展中國(guó)家仍有使用。樣品25 g （mL）+225 mL無(wú)菌生理鹽水10倍系列稀釋選擇2 個(gè)3 個(gè)適宜稀釋度，各以0.1 mL 加入到MRS平板進(jìn)行涂布 乳酸菌總數(shù)計(jì)數(shù)厭氧，36 1 ， 48 h2 h液體樣品：液體樣品： 液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無(wú)菌吸管液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無(wú)菌吸管吸取樣品吸取樣品 25 mL 放入裝有放入裝有225 mL 生理鹽生理鹽水的

9、無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分振搖，制成玻璃珠）中，充分振搖，制成1:10 的樣品勻液。的樣品勻液。步驟步驟1 、用用1 mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品樣品勻液勻液1 mL，沿管壁緩慢注于裝有，沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋的無(wú)菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用液），振搖試管或換用1 支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，均勻， 制成制成1:100 的樣品勻液。的樣品勻液。2、 另取另取1 mL無(wú)菌吸管或微量移液

10、器吸頭，按上述無(wú)菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做操作順序，做 10 倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用一次，即換用1 次次1 mL滅菌吸管或吸頭。滅菌吸管或吸頭。 乳酸菌計(jì)數(shù)乳酸菌計(jì)數(shù) 1 、 乳酸菌總數(shù)乳酸菌總數(shù) 根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計(jì)，選擇根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計(jì)，選擇2 個(gè)個(gè)3 個(gè)連續(xù)個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取0.1 mL樣品樣品勻液分別置于勻液分別置于2 個(gè)個(gè)MRS瓊脂平板，使用瓊脂平板，使用 L 形棒進(jìn)行表形棒進(jìn)行表面涂布。面涂布。36 1 ，厭氧培養(yǎng)，厭氧培養(yǎng) 48 h2 h 后計(jì)數(shù)平后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板涂布要求在板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板涂布要求在15min內(nèi)完內(nèi)完成。成。1. 菌液制備菌液制備:將單菌種將單菌種(嗜熱鏈球菌嗜熱鏈球菌)以脫脂乳以脫脂乳為培養(yǎng)基為培養(yǎng)基,在在361培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15小時(shí)后小時(shí)后,再再以脫脂乳以至于以脫脂乳以至于1:1稀釋待用稀釋待用;2.取待檢樣液取待檢樣液9mL,在在80水浴加熱水浴加熱5分鐘后冷卻到分鐘后冷卻到37以下以下,加活加活菌液菌液1mL,在在361水浴水浴2小時(shí)小時(shí),加入加入4%的的TTC指示劑指示劑0.3mL, 361水浴培養(yǎng)水浴