野生食用菌菌種分離與鑒定技術(shù)規(guī)范

1、DB福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB/×××2007野生食用菌菌種分離與鑒定技術(shù)規(guī)范（報(bào)批稿）200×-××-××發(fā)布200×-××-××實(shí)施發(fā)布福建省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局DB/×××2007前言本標(biāo)準(zhǔn)由福建省科技廳和福建省農(nóng)業(yè)廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：福建省三明真菌研究所、福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心、福建省科技廳星火辦。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：黃年來(lái)、上官舟建、林汝楷、謝寶貴、林津添、張運(yùn)茂、郭美英、朱堅(jiān)、陳曉、吳小平、鄧優(yōu)錦、劉新銳。1DB/×

2、5;×2007野生食用菌菌種分離與鑒定技術(shù)規(guī)范1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了野生食用菌菌種采集、采集前準(zhǔn)備、標(biāo)本采集與保存、菌種分離與鑒別等。本標(biāo)準(zhǔn)僅適用于野生食用菌,不適用于有毒真菌。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單位（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究可以使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T12728-2006食用菌術(shù)語(yǔ)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1食用菌ediblemushroom可食用的大型真菌，常包括食藥

3、兼用和藥用大型真菌，多數(shù)為擔(dān)子菌，如雙孢蘑菇、香菇、草菇、牛肝菌等，少數(shù)為子囊菌，如羊肚菌、塊菌等。GB/T12728-2006，定義2.1.43.2藥用菌medicinalmushroom有藥用價(jià)值的高等(大型)真菌。GBT12728-2006，定義2.1.53.3木腐菌woodrottingmushroom自然生長(zhǎng)在木本植物上可引起木材腐爛的大型真菌。人工栽培的食用菌多數(shù)是木腐菌，如香菇、金針菇等。GB/T12728-2006，定義2.3.103.4草腐菌strawrottingmushroom自然生長(zhǎng)在草本植物殘?bào)w上的大型真菌，如草菇、雙孢蘑菇。GB/T12728-2006，定義2.3.

4、113.52土生菌geophilousmushroom自然生長(zhǎng)在富含有機(jī)質(zhì)的土壤中的各類(lèi)大型真菌。如羊肚菌。GB/T12728-2006，定義2.3.143.6糞生菌coprophilousmushroom以腐熟動(dòng)物糞便為營(yíng)養(yǎng)源的腐生大型真菌。如糞污鬼傘。GB/T12728-2006，定義2.3.153.7菌根真菌mycorrhizalfungus能與植物根系發(fā)生互惠共生關(guān)系形成菌根的真菌。如松口蘑與赤松。由于真菌菌絲深入植物根部程度的不同又有外生菌根和內(nèi)生菌根之分。GB/T12728-2006，定義2.3.193.8分離isolation從基物、子實(shí)體、菌絲培養(yǎng)物中取得純菌種的過(guò)程。GB/T

5、12728-2006，定義2.4.343.9核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)NuclearRibosomalDNAInternalTranscribedSpacers在真菌中，18S、5.8S、28S核糖體RNA的基因串聯(lián)在一起，同時(shí)被轉(zhuǎn)錄，這三個(gè)基因之間被一段DNA序列隔開(kāi)（ITS），18S和5.8S、5.8S和28S的基因之間的間隔區(qū)分別稱(chēng)為ITS1和ITS2，ITS序列具有較高的保守性，種內(nèi)不同菌株之間的ITS序列同源性很高，但種間的差異較大，它可用于種的鑒別。4.采集4.1采集前的準(zhǔn)備4.1.1工具采集前應(yīng)備齊工具。采集工具包括小鏟子或小鋤子、鋸子、高枝剪、柴刀、小籃子、采集袋、小瓶子、接種針、酒精燈

6、、試管培養(yǎng)基、小型烘干設(shè)備、照相機(jī)、閃光燈、三腳架、海拔表或衛(wèi)星定位儀、鉛筆、油膏筆、標(biāo)本記錄表、尺子、放大鏡、當(dāng)?shù)亟煌▓D、指南針及其它需要物品等。4.1.2著裝要求應(yīng)穿長(zhǎng)袖衣服、長(zhǎng)筒褲，扎緊褲腳，以防止被雜草割傷或被蚊蟲(chóng)、螞蟥等叮咬。4.1.3防護(hù)用品應(yīng)帶上草帽、雨傘、雨衣等遮陽(yáng)防雨用具，以及防蚊蟲(chóng)叮咬的清涼油、風(fēng)油精、蛇藥、防中暑藥和解渴充饑的開(kāi)水和干糧等。4.1.4其它3應(yīng)預(yù)先計(jì)劃安排交通工具。應(yīng)根據(jù)行動(dòng)計(jì)劃安排人員，并根據(jù)調(diào)查范圍劃分小組，原則上每個(gè)小組必須為2人以上。應(yīng)制定聯(lián)絡(luò)方式。最好有適當(dāng)?shù)南驅(qū)А?.2標(biāo)本采集與記錄4.2.1野生食用菌采摘用于菌種分離的材料主要是子實(shí)體，在采摘時(shí)

7、應(yīng)盡可能保持子實(shí)體完整，包括菌環(huán)、菌柄基部、菌托等。4.2.2標(biāo)本存放每一種標(biāo)本應(yīng)單獨(dú)存放，防止互相干擾影響鑒定。應(yīng)使用采集袋或樣品盒等，以防止標(biāo)本互相擠壓。4.2.3拍照標(biāo)本采集前應(yīng)進(jìn)行拍照。應(yīng)拍攝子實(shí)體整體（包括菌環(huán)、菌柄基部、菌托等）、菌褶或菌管部分的照片，以及子實(shí)體周邊的生態(tài)照片。4.2.4記錄采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)及時(shí)詳細(xì)記錄標(biāo)本信息。記錄標(biāo)本信息用鉛筆或油筆較好。標(biāo)本記錄表見(jiàn)附錄A。5菌種分離5.1培養(yǎng)基分離菌種常用的培養(yǎng)基見(jiàn)附錄B。5.2菌種分離方法根據(jù)采集菌株的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型和標(biāo)本的完好程度決定是否分離菌種，所有木腐菌、草腐菌、糞生菌和部分土生菌應(yīng)盡可能進(jìn)行菌種分離，菌根真菌如紅菇、乳菇、牛肝

8、菌等不用分離。常用的分離方法包括：a.組織分離法。以無(wú)菌操作方式，用接種針或刀片取子實(shí)體內(nèi)部的一小塊組織接入分離培養(yǎng)基中，在適宜的溫度條件下培養(yǎng)以獲得菌絲純培養(yǎng)；b.耳木分離法。以無(wú)菌操作方式，用接種針或刀片取耳木內(nèi)部的一小塊組織接入分離培養(yǎng)基中，在適宜的溫度條件下培養(yǎng)以獲得菌絲純培養(yǎng)；c.孢子彈射法。以無(wú)菌操作方式，在一支裝有分離用培養(yǎng)基的試管內(nèi)用接種針取一小塊瓊脂粘在試管壁上，再取一小片菌褶粘在試管壁上的瓊脂塊上，試管靜置過(guò)夜，讓菌褶上的擔(dān)孢子彈射到分離用培養(yǎng)基上，在適宜的溫度條件下培養(yǎng)以獲得菌絲純培養(yǎng)。6標(biāo)本保存6.1標(biāo)本在采集當(dāng)天應(yīng)在記錄和分離菌種后及時(shí)烘干。6.2干標(biāo)本帶回單位后應(yīng)及

9、時(shí)處理如分檢、復(fù)烤、裝標(biāo)本瓶，并及時(shí)放入標(biāo)本館妥善保存。7菌種鑒別7.1形態(tài)鑒定對(duì)標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)特征描述后，鑒定方法見(jiàn)附錄C。47.2菌種鑒別7.2.1形態(tài)鑒別觀察分離獲得的野生菌種的菌落形態(tài)及菌絲的顯微特征，與該種類(lèi)的其它菌株進(jìn)行比較，若相同，可判斷所獲得的菌種是正確的，不是雜菌。對(duì)于所采集到的野生菌目前還沒(méi)有對(duì)照菌株，可進(jìn)行出菇試驗(yàn)，若長(zhǎng)出的子實(shí)體與野生子實(shí)體標(biāo)本的形態(tài)特征相同，說(shuō)明所獲得的菌種是正確的，不是雜菌。若形態(tài)鑒別無(wú)法確認(rèn)菌種或有疑義，應(yīng)另作分子鑒別。7.2.2分子鑒別7.2.2.1DNA提取野生菌種在適合的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集菌絲，提取總DNA。同時(shí)取其子實(shí)體標(biāo)本，也提取總DN

10、A。7.2.2.2ITS-PCR野生菌種及其子實(shí)體的DNA分別進(jìn)行ITS-PCR。PCR反應(yīng)的組成及程序如下：PCR反應(yīng)的組成：1l模板DNA(含30ngDNA)，2.5l10×buffer緩沖液，2ldNTP(each2.5mmol/L)，1lPrimerITS1(ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG)(10mol/L),1lPrimerITS4(ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC)(10mol/L)，0.3lTaqDNAPolymerase(5U/ul),用ddH2O將總體積補(bǔ)至25l。ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94預(yù)變性5min；94變性4

11、5s，55退火45s，72延伸1min,35個(gè)循環(huán)，72延伸10min。7.2.2.3ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)取ITS-PCR產(chǎn)物5l加上2l6×溴酚藍(lán)上樣緩沖液，混勻,進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠（含GoldviewTMDNA染料）電泳，160V恒壓電泳1h，通過(guò)紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照像。7.2.2.4ITS片段的克隆與測(cè)序ITS-PCR產(chǎn)物與T-Vector連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性菌落經(jīng)過(guò)菌落PCR驗(yàn)證后，委托生物公司測(cè)序。7.2.2.5菌種鑒別采用DNAMAN軟件比對(duì)野生菌種及其子實(shí)體的ITS序列，如果兩條序列完全吻合，說(shuō)明所獲得的菌種是正確的，不是雜菌。如果同源性較低（低于98%），說(shuō)明所分離的菌種與子實(shí)體標(biāo)本不是同一種,可能是雜菌。5附錄A（規(guī)范性附錄）菌類(lèi)野外采集記錄表*采集號(hào)_標(biāo)本采集份數(shù)_菌名產(chǎn)地生境針葉林闊葉林混交林灌叢草地草原陽(yáng)坡陰坡河邊路旁凹地中名：學(xué)名：經(jīng)緯度：基物：地上腐木立木糞上朽葉海拔：米土質(zhì)：紅壤、沙壤、粘壤、沙地、采集時(shí)間：_年_月_日別名：習(xí)性形態(tài)特征備注采集人：鑒定人：*注：