超氧化物歧化酶的體內吸收與超氧化物歧化酶受體

1、    超氧化物歧化酶的體內吸收與超氧化物歧化酶受體        摘要綜述了有關肝等細胞內吞SOD過程中的形態(tài)學方面的證據和配體印跡等方面的結果，揭示在某些細胞膜表面存在與SOD特異性作用的受體或相關的蛋白質。關鍵詞SOD； 受體； 形態(tài)學； 配體印跡中分類號：R977.3文獻標識碼：A文章編號：1005-8915(2000)03-0184-03 Absorption of SOD and SOD ReceptorHe Huajun, Yuan Qingsheng(Inst

2、itute of Biochemistry，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237)AbstractReview the questions on finding SOD receptor. It is concluded that it has a specific relevant protein interact with SOD on some cellular membrane from the observations of morphologies and immunocytochemistr

3、y，furthermore，the M W of the relevant protein was also obtained.Key WordsSOD receptor, Morphology, Ligand blottingMcCord和Fridovich1首次發(fā)表從牛血紅細胞中發(fā)現超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD，E.C.1.15.1.1)活力以來，因為其獨特的催化超氧陰離子發(fā)生的歧化反應，對維持體內氧自由基的動態(tài)平衡具有重要意義。因此人們對其的保健和醫(yī)學應用進行了許多研究，發(fā)現SOD對防御生物體免受氧自由基損傷、抗輻射、抗腫瘤及延緩機體衰老等方面起著重要

4、作用2。目前，SOD在醫(yī)藥上應用一個突出問題是SOD在血液中的半衰期太短。有幾種方法提出用來克服這個問題：與PEG、白蛋白等偶聯，或脂質體包裹，或化學修飾，被證實對延長其在血清中的半衰期有效；還有通過基因工程增加SOD的Mr，也可以提高其在血清中的穩(wěn)定性；甚至在SOD的基因末端融合一段能識別肝素糖蛋白的基因，這樣使融合蛋白能定位于內皮細胞3。在試驗過程中發(fā)現，雖然SOD在血液中因為腎小球的濾過作用，其半衰期很短；但其作用效果可以持續(xù)幾周甚至幾個月4。這讓人們對SOD的吸收和作用的機制感興趣，這是否與SOD能進入細胞內有關?如果能進入細胞內，SOD的Mr為32000，這么大的分子穿過細胞膜是很困

5、難的事情，那么其作用機制又會是什么樣的呢?是否如LDL(低密度脂質體)一樣，存在特異性受體呢?本文按不同研究的手段和方法，綜述了肝細胞等對SOD的結合和內吞的形態(tài)學研究以及配體印跡等手段對其受體研究的假設和深入研究情況。1熒光標記Mondola等5培養(yǎng)BLA-3A細胞(Buffalo鼠肝細胞)，用2mg/ml的FITC-SOD(異硫氰酸熒光鹽-SOD)在4與其結合30min，熒光顯微鏡觀察可見細胞表面有熒光存在；而用20倍未標記SOD預結合的平行實驗在細胞表面未見熒光出現?？梢奆ITC-SOD能與細胞膜結合，而且未標記SOD能競爭此反應。袁勤生等6把FITC-SOD加入牛主動脈內皮細胞培養(yǎng)液中

6、進行培養(yǎng)，熒光結果顯示標記物進入了培養(yǎng)細胞內。Emerit等4用流式細胞儀方法，5%的胎牛血清避免非特異性結合，結果顯示對培養(yǎng)細胞的自由基損傷的保護效應與FITC-SOD結合到細胞膜表面有關。培養(yǎng)全血細胞除紅細胞外(淋巴細胞、單核細胞和中性白細胞)均出現熒光，且標記程度與FITC-SOD的濃度和結合時間有關。成纖維細胞也觀察到這種現象。FITC-SOD僅僅是結合在細胞的表面還是進入了細胞內?該實驗中還用共焦顯微鏡證實FITC-SOD進入了單核細胞的細胞質。在該實驗中找到了SOD特異性結合的證據：(1) 細胞松弛素B(一種內吞抑制劑)預處理，可見細胞上的熒光標記減少，但并不完全抑制，結合位點看來

7、對SOD是特異性的；(2) 5%的胎牛血清預處理，不競爭SOD的結合反應，細胞依然顯示熒光；(3) 用FITC標記的羊抗鼠IgG溫育，未見熒光出現，可見胎牛血清并沒有特異性進入。2膠體金標記Dini等7培養(yǎng)大鼠肝細胞，與Au5或Au17標記的SOD復合物溫育，結合實驗采用015min，內化實驗采用3760min，非特異性吸附的平行實驗用2×10-4 mmol/LSOD或0.4%BSA(牛血清白蛋白)證實SOD的結合是特異性的，因為BSA不抑制SOD與細胞膜的結合，而用未標記的SOD以抑制標記物的結合；另外，兩種不同表面電荷的SOD(綿羊SOD，pI=8，牛血SOD，pI=5)同樣能結

8、合到膜上。SOD的內化實驗表明：SOD內化前隨機結合在細胞膜上有一個結合位點的構象重排過程，這種現象是一種典型的受體介導內吞的現象7。該研究組還進行了Au5或Au17標記的牛血SOD與Wistar大鼠肝作用的在體(in situ)和體內(in vivo)實驗3。非特異性吸附的平行實驗用2×10-4mol/mlSOD或0.4%BSA。實驗發(fā)現Au17-SOD復合物出現在肝細胞、內皮細胞和枯氏細胞的表面，而Au17-BSA在肝細胞中不出現，僅在內皮細胞和枯氏細胞的表面有10%。2×10-4mmol/LSOD抑制細胞與Au17-SOD結合，而0.4%BSA不影響結合。電鏡顯示Au

9、17-SOD復合物存在于細胞內的小泡中。肝似乎可以積累外源SOD，而腎吸收Au17-SOD復合物的速率遠遠低于肝，心臟未見Au17-SOD的吸收，故肝可能是從血液中清除外源SOD的主要場所。結果還證實：Au17-SOD優(yōu)先于枯氏細胞和內皮細胞結合，內皮細胞首先積累隨后釋放給肝細胞。該組的結果9還證實：在體外，在體和體內的各種模型實驗中，發(fā)現年老的鼠的結合和內化速率都明顯降低，因此，SOD用于治療年老有關的疾病時需重新評價，應考慮到SOD的內吞機制與衰老相關。3放射性標記Simone等10用125I-SOD靜脈注射Wistar大鼠，通過梯度和等密度離心，發(fā)現125I-SOD能快速被肝吸收，而且其

10、作用至少可達150min。證實SOD吸收并積累在細胞內，在溶酶體中能存在一段較長的時間。這也許從另一個方面說明SOD的作用的持久性。Mondola等5用BRL-3A細胞，與50200g/ml125I-SOD4溫育1h，用20倍過量的未標記SOD作抑制實驗。實驗標明150g/ml125I-SOD使細胞表面達飽和。125I-SOD與BRL-3A細胞結合Scatchard作分析，得到Bmax=145ng，Kd=69g/ml。4酶活力Edeas等11150U/ml的SOD與PBLs(外周血淋巴細胞)溫育1h，可使其SOD活力提高1倍，而與熱失活的SOD溫育24h也無作用。而且在0300 U/ml范圍內

11、，隨外加SOD活力單位的增加，PBLs的活力增加。Kyle等12對用甲胺、莫能菌素、苯甲醇、細胞松弛素B和寡霉素等內吞抑制劑，發(fā)現能消除SOD對培養(yǎng)肝細胞的保護作用，肝細胞與SOD溫育1h，能使SOD活力升高4倍，每一種抑制劑均能降低這種與細胞有關的活力變化。真核細胞能連續(xù)地內化其細胞表面，因此外源的大分子物質可通過這種細胞膜的循環(huán)而內化，HRP(辣根過氧化物酶)被認為是這種液相胞飲過程(fluid phase process)的合適標記物13。該實驗中證實溫育SOD和HRP1h后，其內化量前者是后者的200倍。因此肝細胞內吞SOD不僅僅是一種細胞膜連續(xù)循環(huán)的產物，與HRP的內化機制不一樣；而

12、且對內吞抑制劑甲胺的敏感度，SOD遠遠敏感于HRP，因為甲胺對液相胞飲的速率影響很小?？梢奡OD內化與細胞膜的特異性結合有關。5免疫細胞化學Dini等14用培養(yǎng)的Wistar大鼠肝細胞與1mg/ml的未標記重組SOD37分別溫育15min，30min，60min，用電鏡定位內化SOD，固定切片，切片與抗hSOD的單抗溫育過夜，免疫金標染色。非特異性吸附的對照實驗單獨用抗血清蛋白A與Au17標的復合物或者與未偶合的蛋白A預溫育。電鏡免疫金染色實驗證實了hSOD的結合與內化。結合試驗時，hSOD抗體的正反應定位于肝細胞表面，內化實驗顯示hSOD進入了核內體。當與膠體金標的蛋白A溫育，可見非常少的非

13、特異性結合和進入了細胞內，這可能與液相胞飲有關。用未標記SOD實驗的結果消除了因為金復合物蛋白質造成的假象的可能性。Edeas等11對培養(yǎng)PBLs的培養(yǎng)液里分別加入0U，50U，100U，150U和300U的未標記的外源牛血SOD，溫育24h，然后充分沖洗，加入120稀釋的綿羊抗人Cu*Zn-SODIgG，和綿羊抗人Mn-SODIgG(綿羊抗人Cu*Zn-SODIgG，和綿羊抗人Mn-SODIgG與Cu*Zn-SOD及Mn-SOD之間沒有交叉反應)，然后用1100HRP標的兔抗綿羊IgG溫育，染色。結果顯示：外源SOD穿過了細胞膜，而且其定位靠近核膜，可能在核膜上也有SOD的結合位點存在。6配

14、體印跡Mondola等5制備BRL-3A細胞膜，行未變性SDS-PAGE，然后轉移到硝酸纖維素膜上，充分沖洗后，1份與125I-SOD溫育，另1份除125I-SOD外加20倍過量的未變性SOD溫育過夜，放射自顯影，發(fā)現在約Mr1320000處有一清晰的條帶。可見在細胞膜表面存在有與SOD特異性相互作用的受體或其它蛋白質。從形態(tài)學及配體與受體的相互作用看出：SOD可以特異性進入細胞內，且用125I-SOD與細胞膜相互作用得到其Bmax和Kd；另外，用配體印跡的方法得到有一與125I-SOD相互作用的約Mr 320000的蛋白質。那么在某些細胞表面是否存在SOD受體呢?可以肯定在肝細胞等細胞表面存

15、在與外源SOD特異性相互作用的蛋白質，但是否就是SOD受體呢?可能是SOD受體或者對SOD也有作用的其它受體或蛋白。目前，仍沒有分離純化到SOD受體的報道，因為受體僅占細胞膜總蛋白的一小部分，分離純化困難，親和層析有可能因為改變了配體與受體相互作用的位點而使分離純化變得困難。相信在不久的將來，可望用表達克隆法15或酵母雙雜交系統16從基因庫中調出與SOD相互作用蛋白的基因。到時就可闡明對SOD吸收、利用的機制，為SOD的應用建立堅實的理論基礎。賀華君（華東理工大學生物化學研究所，上海 200237）袁勤生（華東理工大學生物化學研究所，上海 200237）參考文獻1，McCord，J M，Fri

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