褪黑素對大鼠腸缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究(一)

1、褪黑素對大鼠腸缺血/再灌注損傷保護作用的實驗研究(一)    【關(guān)鍵詞】 褪黑素摘 要 目的：觀察褪黑素對大鼠腸缺血/再灌注損傷的保護作用。方法：成年雄性SD大鼠60只分為假手術(shù)組(10只)、缺血/再灌注組(10只)、缺血/再灌注褪黑素20 mg/kg組(15只)。觀察腸缺血30 min再灌注60 min后腸黏膜損傷程度，測定血中D乳酸和內(nèi)毒素水平，并測定小腸組織中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平和誘生型-氧化氮合酶(iNOS)活力。結(jié)果：運用褪黑素組腸黏膜損傷程度輕，MDA、NO、iNOS和D乳酸、內(nèi)毒素均低于缺血/再灌注組和溶媒組，并呈劑量依賴

2、效應(yīng)。腸黏膜損傷程度與MDA、NO及D乳酸呈正相關(guān)。結(jié)論：運用褪黑素對大鼠腸缺血/再灌注損傷有保護作用，效應(yīng)呈劑量依賴性。這種作用的部分原因可能是褪黑素抑制了NO的過度生成。關(guān)鍵詞 褪黑素；缺血/再灌注；腸屏障；一氧化氮Experimental Study on the Protective Effects of Melatonin on Intestinal Ischemiareperfusion Injury in RatsAbstract：Objective The purpose of this study was to assess the protective effect of

3、melatonin on intestinal ischemiareperfusion (IIR)injury in rats.Methods IIR injury was induced by clamping the superior mesenteric artery in rats for 30 min,follow by relase of the clamp(reperfusion),Melatonin(10 mg/kg,20 mg/kg)or vehicle(control 2% alcohol)was administered twice,5 min prilr to repe

4、rfusion and 30 min after the reperfusion period,At 60 min after reperfusion,rats were decapitated.Serum samples were decapitated.Serum samples were taken for hisological examination or the detdrmination of malondialdehyde(MDA),nitric oxide(NO),catalase(CAT)and inducible isoform of nitric oxide synth

5、ase(iNOS)activity Plasma Dlactate and endotoxin concentrations were measured for the eva lration of intestinal permeability.Results Compared with the shamoperation group,Dlactate,endotoxin and MDA,NO,iNOS were significantly increased,white CAT was decreased in ischemiareperfusion group.Comjpared wit

6、h ischemiareperfusion group and vehicle administered group,these changes were reverted to some degree by treatment with melatonin in a dosedependent menner.The histopathologic results were consistent with the biochemical markers.Conclusion Melatotin protects effectively intestine from ischemiareperf

7、usion injury,the reason may inhibit the production of nitric oxide,and this effect is exerted in a dosedep endent manner.Key words：Melatonin;Ischemiareperfusion;Intestine barrier;Nitric oxide腸缺血/再灌注損傷不僅導(dǎo)致腸道局部組織壞死、凋亡，還將引發(fā)全身炎性反應(yīng)失控，對其他器官組織產(chǎn)生廣泛影響，嚴(yán)重者會導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征1，2。褪黑素是目前發(fā)現(xiàn)最強的體內(nèi)抗氧化成分，在心、腦、腎等器官缺血/再灌注損傷中

8、有明顯保護作用3。本文擬建立大鼠腸缺血/再灌注模型，觀察褪黑素對腸缺血/再灌注損傷的影響。1 材料與方法11 實驗動物與分組 雄性SD大鼠60只(蘭州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，體重200 g250 g，隨機分為5組：假手術(shù)組10只，僅分離腸系膜上動脈；缺血/再灌注組10只，分離并鉗夾腸系膜上動脈，腹腔注射生理鹽水；缺血/再灌注+注射溶媒組10只，分離并鉗夾腸系膜上動脈，腹腔注射2無水乙醇，生理鹽水；褪黑素不同劑量組，各15只。褪黑素(購自瑞士ALEXIS公司)先以無水乙醇將褪黑素溶解，再加生理鹽水稀釋，使乙醇濃度2，然后按褪黑素10 mg/kg、20 mg/kg等容分別腹腔注射。12 腸缺血/

9、再灌注模型的制作 動物禁食18 h，不禁水。手術(shù)室溫度維持在27 28 ，稱重，麻醉采用戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射。腹部正中脫毛，消毒鋪巾，正中切口進腹，分離腸系膜上動脈，以無創(chuàng)血管夾夾閉腸系膜上動脈根部，30 min后松開血管夾，進行再灌注。在再灌注前5 min，組腹腔注射溶劑，組腹腔注射褪黑素，再灌注30 min后進行第二次腹腔注射。再灌注60 min后立即切取距回盲瓣5 cm的小腸，分別墨4多聚甲醛固定在水浴下制備110腸勻漿，備測，并經(jīng)心臟穿刺取血，置-20 冷凍保存。13 觀察指標(biāo)131 組織勻漿制備及檢測 在冰浴下將切取的小腸縱行剖開，在冰0.01 mol/L PBS中漂洗

10、，濾紙吸干，準(zhǔn)確稱取1 g小腸組織，制成10%組織勻漿，低溫離心，取上清液，進行內(nèi)二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)、過濾氧化氫酶(CAT)測定。試劑盒購自南京建成生物工程研究所。132 小腸組織切片行HE染色，光鏡下觀察組織損傷程度 采用Chiu氏6級評分法判斷損傷程度：0分為正常黏膜絨毛，1分為絨毛頂端上皮下間隙增大，2分為上皮層與固有層中度分離，3分為絨毛兩側(cè)亦有大量分離伴部分絨毛頂端破損，4分為絨毛破損伴固有層毛細血管暴露，5分為固有層破壞、出血、潰瘍。133 血D乳酸及內(nèi)毒素測定 血漿D乳酸根據(jù)Brandt用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進行單因素方差分析

11、及組間比較，并進行指標(biāo)間Pearson相關(guān)分析。2 結(jié)果21 模型建立情況 各組行腸缺血/再灌注模型制作時，夾閉腸系膜上動脈后腸系膜血管搏動消失且腸壁變蒼白。開放血管后血管搏動恢復(fù)，腸壁出現(xiàn)充血。再灌注60 min后腸壁充血水腫明顯。2.2 各組實驗指標(biāo)數(shù)間比較 與缺血/再灌注組相比，注射褪黑素組病理評分及組織中MDA、NO、iNOS均明顯降低，差異有顯著性(P005)。隨著褪黑素濃度增高，病理評分與MDA、NO、iNOS測量值有下降趨勢，其中組與組間MDA水平無統(tǒng)計學(xué)意義。與假手術(shù)組相比，血漿中D乳酸及內(nèi)毒素各組均明顯升高，而褪黑素組D乳酸、內(nèi)毒素與溶媒組比較呈下降趨勢，并有統(tǒng)計學(xué)意義(P0

12、05)。見表1，表2。表1 實驗指標(biāo)的各組間均數(shù)比較（略）表2 實驗指標(biāo)的各組間均數(shù)比較（略）23 各實驗指標(biāo)之間相關(guān)性分析 病理學(xué)評分與血清D乳酸、NO、iNOS水平呈正相關(guān)，而與CAT水平呈負相關(guān)。3 討論腸缺血/再灌注損傷不僅見于腸梗阻、腸系膜動脈栓塞等急腹癥，更是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷后休克復(fù)蘇中出現(xiàn)的病理過程，導(dǎo)致腸上皮細胞死亡，腸黏膜膜屏障破壞，腸通透性增加，使內(nèi)毒素吸收增加及細菌易位，引發(fā)或加重全身炎性反應(yīng)1，2。缺血/再灌注時超氧陰離子(O2)、NO生成增加和過氧亞硝基陰離子(ONOO)濃度增高是造成再灌注損傷的重要原因。再灌注時富含黃嘌呤氧化酶的腸上皮細胞將產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致細胞

13、膜破壞，引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)；實驗表明過量的NO可造成腸黏膜通透性的增加，其機制是NO與O2結(jié)合，形成ONOO，ONOO具有很強的毒性，包括引發(fā)脂質(zhì)過氧化，抑制線粒體酶活性，破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細胞死亡6，7，這使得腸屏障受損，腸黏膜通透性增高導(dǎo)致內(nèi)毒素轉(zhuǎn)位，血中內(nèi)毒素水平上升。因此，清除并抑制自由基過量生成是防治腸缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵。褪黑素主要由松果腺分泌，具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、調(diào)節(jié)免疫等作用。近年來發(fā)現(xiàn)褪黑素具有很強的抗氧化和清除自由基作用，不僅可直接清除OH、O2等，還可通過增加抗氧成分3，8。MDA作為組織過氧化產(chǎn)物的標(biāo)志，其水平反映組織過氧化的程度。本文發(fā)現(xiàn)應(yīng)用褪黑素組腸組織MD

14、A水平明顯降低，而作為細胞內(nèi)抗氧化成分CAT活力增加，進一步證實褪黑素的抗氧化作用。NO參與調(diào)節(jié)腸黏膜的通透性，本實驗中假手術(shù)組與對照組NO的水平增高，而褪黑素組NO水平及iNOS活力明顯低于對照組，并與腸黏膜損傷程度正相關(guān)。血中內(nèi)毒素水平與對照組比較也明顯降低，且呈劑量依賴性。證實褪黑素能減少腸組織缺血/再灌注損傷后NO的過度產(chǎn)生，從而進一步減少ONOO的生成，保護腸組織。Cuzzocrea等9在大鼠內(nèi)臟動脈閉塞再灌注模型中也觀察到，褪黑素治療明顯降低了由再灌注損傷升高的血漿和回腸中ONOO水平，還減少了再灌注回腸組織P選擇素和粘附因子(ICAM1)的表達，進而減輕中性粒細胞介導(dǎo)的細胞損害，

15、并且提高了大鼠的生存率。褪黑素減少NO的生成，其機制可能是褪黑素抑制了NFkB的活性，阻止iNOS的表達造成直接抑制NOS的活性10，11。D乳酸是腸道細胞特有的代謝產(chǎn)物，不參與體內(nèi)的代謝過程，正常情況下血中很難測到，腸黏膜受損，通透性增加，其進入血液循環(huán)。動物實驗證明，急性腸缺血引起的腸黏膜損傷可使D乳酸濃度升高12。也有報道血漿D乳酸的濃度與腸黏膜損傷評分值呈顯著相關(guān)13，14。本實驗中褪黑素組D乳酸水平下降，說明褪黑素可能通過減少氧自由基、NO的產(chǎn)生改善腸黏膜屏障的通透性。另外，最近發(fā)現(xiàn)褪黑素還有抗應(yīng)激、抗炎、增強免疫及調(diào)節(jié)性激素、鎮(zhèn)痛作用。胃腸道也是其分泌來源，而且也存在其受體，具有調(diào)

16、節(jié)胃腸蠕動、改善黏膜血流、促進細胞增殖等作用15，16，說明其在腸缺血/再灌注損傷中不僅僅是通過清除自由基而發(fā)揮保護作用，其作用機制有待進一步的研究。參考文獻：1Sheng ZY,Dong YL.Bacterial translocation and multiple system or gan failure in bowel ischemia and reperfusion J.J Trauma,1992,32:148153.2Monre FA.The role of the gastrointestinal trade in postinjury multiple organ failu

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