蛋白表達重組質(zhì)粒構(gòu)建是否遇到過如下問題

1、本實驗源于一次失敗的實驗，從平板挑單菌落提取載體pET-32a（+），從EcoR和Hind 酶切位點插入PCR產(chǎn)物-PrP435。但由于單菌落所得載體pET-32a（+）在EcoR位點突變，由GAATTC突變?yōu)镚AATTA（已測序），按第一章方法構(gòu)建重組表達質(zhì)粒PrP-pET-32a（+），在4連接過夜、TSS法轉(zhuǎn)化E.coli DH5a未獲成功。而將一周以后在4保存的連接液TSS法轉(zhuǎn)化E.coliDH5 a卻獲成功。我們利用雙引物primergenome進行菌落PCR篩選陽性克隆時發(fā)現(xiàn)，本應(yīng)擴增出430 bp的DNA片斷，實驗結(jié)果卻擴增出約1300 bp，860 bp，430 bp三個DNA

2、條帶。消除所有污染因素后，結(jié)果依然是三個DNA條帶。由此我們懷疑可能是PCR產(chǎn)物串聯(lián)以后連入pET-32a（+）。根據(jù)以上現(xiàn)象我們對結(jié)果作如下探索：疑似串聯(lián)重組質(zhì)粒命名為PrPX-pET-32a（+），PrPX-pET-32a（+）轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），進行表達鑒定；EcoR單酶切PrPX-pET-32a（+），瓊脂糖凝膠回收，重新連接，試圖獲得單拷貝陽性克??；用引物primervector進行菌落PCR鑒定；使用5primergenome單引物進行菌落PCR篩選鑒定； PrPX-pET-32a（+）和pET-32a（+）測序。試驗結(jié)果表明：表達出49 KD蛋白，比單拷貝克隆表

3、達蛋白（35 KD）多15 KD，相當于2倍拷貝串聯(lián)克隆表達蛋白大小。由于插入片段已突變出兩個終止子，所以我們認為PrP435串聯(lián)數(shù)應(yīng)在2以上，前一拷貝應(yīng)為反向插入，而后一拷貝應(yīng)為正向插入。使用5primergenome單引物進行菌落PCR，試驗結(jié)果擴增出約860 bp，420 bp，兩個DNA片段，420 bp附近有稍大模糊條帶，據(jù)此我們認為：串聯(lián)數(shù)應(yīng)在4以上。因為，由圖3-5，使用5primergenome單引物進行菌落PCR時，上游因物在E1-E6處和PrPX-pET-32a（+）退火，下游引物在H1-H5處和PrPX-pET-32a（+）退火，上游因物帶有EcoR酶切位點可以與載體上E

4、0產(chǎn)生錯配。所以E1和H1之間可擴增出430 bp片段，E1和H5之間可擴增出約1300 bp片段，E1和E4之間可擴增出約860 bp片段。E1和3之間Taq酶同時往中間擴增，Taq酶要占一定的空間，就會使下游引物所加的Hind 酶切位點和三個保護性堿基消失一部分，擴增出約420 bp（比430 bp小）條帶。其他各條帶可同理推出。圖3-5串聯(lián)質(zhì)粒PrPX-pET-32a（+）多克隆位點Fig.3-5 The MCS of cascade recombinant PrPX-pET-32a（+） sense strand ， anti- sense strand ， H Hind ，E Eco

5、R， vector本實驗早期我們用EcoR單酶切PrPX-pET-32a（+），瓊脂糖凝膠回收，并重新連接，試圖獲得單拷貝陽性克隆，但重復(fù)多次，經(jīng)表達鑒定，未獲成功。原因是EcoR位點突變（已測序）。以后重復(fù)該實驗所用pET-32a（+）EcoR位點完好，EcoR單酶切PrPX-pET-32a（+），瓊脂糖凝膠回收，重新連接，實驗結(jié)果獲得單拷貝陽性克隆。PrPX-pET-32a（+）經(jīng)上海聯(lián)合基因公司和上?；祷蚬緶y序均未獲成功。原因可能是串聯(lián)克隆造成的多個長回文序列，形成DNA的某種二級結(jié)構(gòu)造成測序困難。雖本實驗然重復(fù)出了失誤實驗的結(jié)果，表達出了相應(yīng)的蛋白作，但也只是一次探索。建議對以下

6、三個方面作進一步得把探索性研究，首先由于測序無法完成，可進一步做Western-Blot鑒定（使用牛朊蛋白單抗做過兩次，非特異性較強，未能得到好的照片）；其次，此方法上游第一個連入拷貝為反向反意義鏈并產(chǎn)生一個終止子，導(dǎo)致蛋白表達量很低，而且為無用蛋白，若能將引物primergenome兩個酶切位點作顛倒，使用單酶切兩種PCR產(chǎn)物（酶切位點相互顛倒），作連接以后，再做克隆，可克隆入完全正向連接的串聯(lián)克隆；再次，此方法上游第一個連入拷貝為反向反意義鏈，可表達出PrP核心片段的反義肽，可做反義肽方面的進一步探索。有時候?qū)嶒炛谐霈F(xiàn)串連并不是我們所期望的，如何避免串連，提高連接效率?筆者做過這方面的探討

7、。具體如下：由于細菌在遺傳上的不穩(wěn)定性，在進行細菌操作時，應(yīng)挑選多個菌落。在實驗過程中曾經(jīng)遇到pET-32a（+）EcoR位點由GAATTC突變?yōu)镚AATTA（已測序），造成連接以后連接產(chǎn)物的串聯(lián)，就是由于在操作過程中挑選單個菌落造成的。重組質(zhì)粒構(gòu)建通常使用酶切然后膠回收再連接、轉(zhuǎn)化，最后進行陽性克隆鑒定的方法。但實驗中經(jīng)常遇到酶切操作困難和膠回收量低、轉(zhuǎn)化效率低、串連等問題。特別是進行雙酶切時，由于兩個酶在通用buffer中的效率不一致，瓊脂糖凝膠電泳無法區(qū)分單酶切和雙酶切，連接產(chǎn)物中可能混有大量的空載體，這樣就會給陽性克隆篩選帶來麻煩。還有可能由于過多的劇烈條件造成酶切產(chǎn)物個別核苷酸的丟失

8、，還可造成重組質(zhì)粒的錯義突變甚至無義突變。我們將重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法略加改進，取得了良好的效果和重復(fù)性。具體操作介紹如下：pET-32a（+）去RNA，經(jīng)溶液、溶液、氯仿、乙醇沉淀。將pET-32a（+）與PCR產(chǎn)物按1：20的比例混合，EcoR和Hind 雙酶切2小時。酶切產(chǎn)物不進行任何形式的純化，直接用1/10量連接2小時。連接產(chǎn)物立即轉(zhuǎn)化E.coli DH5，在含50 ug/ml AMP 的液體TB培養(yǎng)基中過夜，收集細菌提取質(zhì)粒、純化。用pET-32a（+）多克隆位點上EcoR和Hind 之間已被雙酶切去除的Sal位點對應(yīng)酶Sal單酶切（圖18），使pET-32a（+）空載體線性化。酶切產(chǎn)

9、物轉(zhuǎn)化E.coli BL-21，涂布含50 ug/ml AMP LB平板，挑單菌落進行菌落PCR，篩選陽性克隆。轉(zhuǎn)化E.coli BL-21之前也可進行陽性克隆富集。上述包含陽性克隆和pET-32a（+）空載體混合質(zhì)粒，用Sal和Xhol雙酶切，乙醇回收去掉小片段， T4DNA連接酶連接反應(yīng)體系同上。TSS緩沖液轉(zhuǎn)化E.coli BL-21（DE3）。（圖1-7， 1-8）圖1-7 一種新的重組質(zhì)粒構(gòu)建方法Fig.1-7 A new method for the contruction of recombinant plasmid圖1-8 pET-32a（+）多克隆位點Fig. pET-32a（+） MCS此方法具有很大的跳躍性，不需檢測酶切是否完全，Sal單酶切使pET-32a（+）空載體線性化。E.coli BL-21的轉(zhuǎn)化效率大約是E.coli DH5的1/10（見pET System Manual22頁），線性化pET-32a（+）比超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率低的多，線性化空載體轉(zhuǎn)入E.coli BL-21的幾率很小。經(jīng)兩次富集陽性克隆，菌落PCR篩選陽性克隆率幾乎100%。傳統(tǒng)方法使用膠回收pET-32a（+）的濃度很低，難于測定OD260值，載體和PCR產(chǎn)物比例不當很容易造成串聯(lián)，本方法未將載體和PCR