海洋微生物活性物質(zhì)分離提取方法研究進展

1、第卷第期大慶師范學院學報！生！旦型墾塑墜旦壘！叢堡盟墾叢壘型盟！墾墜！羔墮塑堡！生墮！：墊！海洋微生物活性物質(zhì)分離提取方法研究進展張奕婷，遲海洋，張麗霞，祖國仁（大慶師范學院生命科學學院，黑龍江大慶；廣東食品藥品職業(yè)學院國際學院，廣東廣州；大連工業(yè)大學生物與食品工程學院，遼寧大連）摘要：海洋微生物可提取分離出多種生物活性物質(zhì)。通過參考大量文獻資料，介紹了海洋微生物的種類，及其產(chǎn)生的多糖和各種生物酶等活性物質(zhì)的主要功能；闡述了用于提取活性物質(zhì)的膜技術(shù)和色譜技術(shù)的現(xiàn)狀，并對海洋微生物研究領(lǐng)域的發(fā)展進行了展望。關(guān)鍵詞：發(fā)酵工程；海洋微生物活性物質(zhì)；膜技術(shù)；色譜技術(shù)作者簡介：張奕婷（一），女，黑龍江大

2、慶人，大慶師范學院生命科學學院教師，從事發(fā)酵及生物工程下游技術(shù)研究。中圖分類號：文獻標識碼：文章編號：（）收稿日期：一海洋覆蓋著地球表面積的，是生命的發(fā)源地，生物種類多萬種，其生物量約占地球生物量的，其生物多樣性遠遠超過陸地生物的多樣性。可以說海洋是地球上最大的資源能源寶庫。海洋環(huán)境條件惡劣，具有高鹽、高壓、低溫、低光照、寡營養(yǎng)、低溶氧等特點，為了適應(yīng)這樣的生存環(huán)境，海洋生物在新陳代謝、生存繁殖方式和適應(yīng)方式等方面產(chǎn)生了與陸地生物不同的代謝系統(tǒng)和機體防御系統(tǒng)。因此在海洋生物及其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多具有特異、新穎、多種多樣化學結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì)，包括抗腫瘤化合物、腫瘤促進劑、抗炎癥過敏化合物、抗

3、菌、抗病毒化合物、生物毒素、抗寄生蟲化合物、多不飽和脂肪酸等，其中相當部分生物活性物質(zhì)是陸地生物所沒有的。這些海洋生物活性物質(zhì)具有種類繁多、結(jié)構(gòu)特異及活性強等特點，再加上目前陸地資源的不斷開發(fā)，發(fā)現(xiàn)新的代謝物的可能性日趨減少，帶來了對新的生物來源的強烈需求，有關(guān)海洋生物活性物質(zhì)的研究已經(jīng)引起國內(nèi)外的重視。海洋天然產(chǎn)物的特異結(jié)構(gòu)和藥理作用是陸源生物所無法比擬的，海洋藥物具有顯著的藥理穩(wěn)定性和強效性，毒副作用相對較小，對防治癌癥、艾滋病、心腦血管病、老年病等疑難病癥具有獨特效應(yīng)，已成為開發(fā)新藥、特藥的主要方向之一。隨著海洋生物活性物質(zhì)的研究不斷加強，海洋微生物的研究開發(fā)也受到世界矚目。海洋微生物有

4、產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的巨大潛力，目前發(fā)現(xiàn)的許多海洋生物活性物質(zhì)都分離自海洋微生物，并且發(fā)現(xiàn)以前有些被認為是海洋動植物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)實際上是由與動植物宿主共生的微生物所產(chǎn)生。因此，海洋微生物生物活性物質(zhì)的研究已成為開發(fā)海洋資源的重要內(nèi)容之一。海洋微生物的定義及其種類目前，關(guān)于什么是真正的海洋微生物仍有爭議。一般認為，分離白海洋環(huán)境，其正常生長需要海水，并可在寡營養(yǎng)、低溫條件下生長的微生物即可視為嚴格的海洋微生物。然而，有些分離白海洋的微生物，其生長不一定需要海水，但可產(chǎn)生不同于陸地微生物的代謝物（如溴代化合物抗生素）或擁有某些特殊的生理性質(zhì)（如鹽耐受性、液化瓊脂等），也被視為海洋微生物。這些微生

5、物中不僅包括海洋中生物起源的種類，而且還包含陸地起源后流人海洋中并適應(yīng)了的微生物種類，幾乎包括了所有的微生物種類。如病毒等非細胞類生物、以產(chǎn)甲烷細菌和嗜鹽細菌為代表的古細菌、陸地環(huán)境常見的細菌種類以及種類繁多的真核微生物。海洋微生物產(chǎn)生的生物活性代謝產(chǎn)物有關(guān)海洋微生物產(chǎn)生生物活性代謝產(chǎn)物的大量研究工作在世紀年代以后展開，現(xiàn)已知的海洋微生物所產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)種類包括新型抗生素、抗癌藥物、不飽和脂肪酸、酶、酶抑制劑、維生素、毒素等，還有不少海洋微生物代謝物結(jié)構(gòu)新穎，但其功能還有待開發(fā)。其中對于海洋微生物產(chǎn)生的多糖類物質(zhì)和酶的研究比較深入。海洋微生物多糖近二十年來，由于分子生物學的發(fā)展，人們漸漸認

6、識到糖及其復合物分子具有極其重要的生物學功能。多糖是構(gòu)成生物體的一類十分重要的有機化合物，與免疫功能的調(diào)節(jié)、細胞間的識別、細胞間物質(zhì)的運輸?shù)榷加兄芮械年P(guān)系，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。多糖的種類各異，在生物體中行使著不同的功能。人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有許多方面的生物活性，且多數(shù)無毒，可以成為理想的藥物來源。近年來，隨著海洋藥物和海洋保健生物制品的蓬勃發(fā)展，海洋多糖類物質(zhì)的研究引起了廣泛重視，經(jīng)科研和實踐證明，海洋多糖及其降解產(chǎn)物具有多種新型的生理活性，在醫(yī)藥、化妝品、食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)等方面具有重要的應(yīng)用價值。海洋微生物酶海洋微生物酶的開發(fā)和利用是實現(xiàn)海洋資源高值化的關(guān)鍵技術(shù)之一。海洋生態(tài)環(huán)境的復雜使得海洋微

7、生物的遺傳結(jié)構(gòu)和生理習性發(fā)生適應(yīng)性的改變，從而產(chǎn)生出具有獨特生理活性的酶系。利用從海洋微生物中分離提取的多糖降解酶對海洋生物多糖進行降解，得到具有新型生物活性的低聚糖組分，并逐漸發(fā)展到海洋多糖降解酶及其酶解產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)，將會有效地推動海洋多糖活性物質(zhì)的開發(fā)和利用，從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。幾丁質(zhì)（殼聚糖）降解酶幾丁質(zhì)是廣泛分布于自然界的生物多聚物。幾丁質(zhì)及殼聚糖經(jīng)水解后得到的寡糖具有多種生理功能，如改善腸道微生物區(qū)系，促進腸道有益微生物的生長，降低血液膽固醇含量，提高機體免疫功能等。因此，幾丁質(zhì)和殼聚糖的降解尤其是酶法降解成為近期人們關(guān)注的熱點。酶法降解包括專一性酶解法和非專一性酶

8、解法，前者是利用從細菌、真菌及某些動植物體內(nèi)提取的幾丁質(zhì)（殼聚糖）酶對底物進行專一性降解。在海洋中，由于浮游生物在生長過程中進行規(guī)律性的換殼，形成大量的幾丁質(zhì)，為幾丁質(zhì)降解微生物的生長繁殖提供了豐富的碳源和能源。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和殼聚糖酶的細菌包括：粘細菌（）、生孢噬細菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、弧菌屬（）、腸桿菌屬（）、克雷伯氏菌屬（）、假單胞菌屬（）、沙雷氏菌（）、色桿菌屬（）、梭菌屬（）、黃桿菌屬（）等；放線菌，如節(jié)桿菌屬（）、鏈霉菌屬（）等；真菌如曲霉屬（）、青霉屬（）、根霉屬（）等。褐藻膠降解酶褐藻膠存在于海帶等褐藻細胞間質(zhì)中。褐藻膠酶可以水解甘露糖醛酸和古羅糖醛酸殘

9、基間的，糖苷鍵，其主要來源是海洋中的微生物和食藻的海洋軟體動物如海螺、鮑魚等。褐藻膠產(chǎn)生菌包括弧菌、黃桿菌（）、固氮菌（）、克雷伯氏菌（、）、假單胞菌（、）、腸桿菌（）、別單胞菌、芽孢桿菌等。早在年，就從海水和海底沉積物以及藻體上分離到能降解褐藻膠的菌種。多年的科研和實踐證明，褐藻多糖具有多種生理活性和廣泛的應(yīng)用價值，而酶解得到的低分子片段，在醫(yī)療保健等方面的多種功效的逐漸認識，更是成為人們關(guān)注的焦點分子量小于的褐藻膠寡糖可作為人表皮角質(zhì)化細胞的激活劑，聚合度的寡聚甘露糖醛酸或古羅糖醛酸可用于制作礦物吸收促進劑。另外，人們還發(fā)現(xiàn)褐藻膠寡糖對植物的生長具有促進作用，在化工行業(yè)也有一定的應(yīng)用價值。

10、褐藻膠酶還可作為海藻解壁酶的組成部分，可用于海藻的細胞解離，以獲得其單細胞和原生質(zhì)體。瓊膠降解酶瓊膠是一種親水性紅藻多糖，包括瓊脂糖和硫瓊膠兩種組分。瓊膠降解形成的低聚糖產(chǎn)物可作為功能性食品和藥品的原料或添加劑，近年來在日用化工領(lǐng)域又發(fā)現(xiàn)瓊膠寡糖的一些新用途，日本利用瓊膠寡糖作為添加劑生產(chǎn)的化妝品對皮膚具有很好的保濕效果，對頭發(fā)也有很好的調(diào)理效果。降解瓊膠的酶可以從微生物和一些軟體動物中分離得到，如黑指紋海兔（）、鮑（）、濱螺（）、冠海詹（）等。瓊膠降解菌主要存在于海洋環(huán)境中，這些降解菌可分為兩類：一類菌軟化瓊膠，在菌落周圍出現(xiàn)凹陷；另一類菌則劇烈地液化瓊膠。潮汐帶淤泥中含有的瓊膠降解菌可達，

11、大約占淤泥中所有好氧細菌的。自從年第一次從海水中分離到瓊膠的分解細菌假單胞菌（）以來，人們已經(jīng)從海洋環(huán)境中分離到多種瓊膠分解菌，包括：噬細胞菌屬（）、芽孢桿菌屬、弧菌屬、別單胞菌屬、假別單胞菌屬（）及鏈霉菌屬等纖維素降解酶纖維索為自然界第一大糖，人們很早就知道細菌和霉菌能夠降解纖維素，直至年，才從耐熱性纖維素細菌中分離出纖維素酶。纖維素酶可用于生物紡織助劑，棉麻產(chǎn)品的磨洗等后處理。用于海藻解壁及生物肥料加工等。隨著海藻工業(yè)的迅猛發(fā)展，大量的海藻加工廢棄物產(chǎn)生并排放到環(huán)境中，造成極為嚴重的環(huán)境污染問題，利用纖維素酶降解海藻加工廢棄物，得到易被植物吸收利用的低聚分子片段，制成生物肥料，同時解決了環(huán)

12、保問題。利用細菌、放線菌、真菌對自然環(huán)境中的野生植物和廢棄纖維素產(chǎn)品進行降解再利用，可以生產(chǎn)乙醇、糠醛等各種工業(yè)產(chǎn)品，同時還可以回收大量的微生物單細胞蛋白。等人利用紫菜粉或木聚糖分離到株細菌，包括黃桿菌、別單胞菌、不動桿菌屬（）和弧菌，它們具有多種糖苷酶活性，能夠降解紫菜等海藻的細胞壁多糖，包括木聚糖、紫菜多糖、甘露聚糖和纖維素，得到紫菜細胞的原生質(zhì)體。海洋微生物生物活性代謝產(chǎn)物的分離和提取海洋微生物產(chǎn)生的天然代謝產(chǎn)物主要包括：多糖、多肽、脂肪酸、皂甙、萜類、大環(huán)聚酯類、聚醚類等化合物，具有結(jié)構(gòu)復雜、多樣性、高生物活性等突出特點。因此海洋生物活性物質(zhì)的篩選、提取、純化是一項十分困難的工作，用傳

13、統(tǒng)的化學方法難以實現(xiàn)，比如多糖類物質(zhì)。多糖是極性大分子化合物，大多采用不同溫度的水、稀堿溶液提取，盡量避免在酸性條件下提取，以防引起糖苷鍵的斷裂，稀酸提取時，時間宜短、溫度不宜超過。萃取技術(shù)傳統(tǒng)的液一液萃取分離技術(shù)成本比較低、易于運作，已廣泛應(yīng)用于多組分物質(zhì)的分離。但由于溶劑的局限性，難于分離大分子生物活性物質(zhì)。近年來，一些新的萃取技術(shù)顯示了良好的應(yīng)用前景。超臨界流體萃取技術(shù)超臨界流體萃取技術(shù)是以超臨界狀態(tài)下的流體為溶劑，利用該狀態(tài)下的流體所具有的高滲透能力和高溶解能力分離混合物的過程。超臨界流體是溫度與壓力均在其臨界點之上的流體，性質(zhì)介于氣體和液體之間，由于液體相接近的密度，與氣體相接近的黏

14、度及高的擴散系數(shù)，故具有很高的溶解能力及良好的流動、傳遞性能，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有毒、易燃、易揮發(fā)的有機溶劑。最常用的超臨界流體二氧化碳，由于具有臨界條件溫和、對大部分物質(zhì)呈化學惰性、無色無味無毒、物溶解污染、易制成高純度氣體，不易點燃等優(yōu)點，特別適用于熱敏性、易揮發(fā)、易氧化成分的分離萃取，已經(jīng)被廣泛使用?，F(xiàn)在可利用超臨界萃取技術(shù)分離提取的海洋活性物質(zhì)有海洋生物毒素、萜類化合物、海洋天然色素、某些稀有氨基酸等。反膠束萃取技術(shù)雙親物質(zhì)（表面活性劑）溶于非極性有機溶劑，當濃度大于臨界膠團濃度時，在有機相中會自發(fā)形成聚集體，成為反膠束。反膠束中極性頭朝內(nèi)，非極性頭朝外形成親水內(nèi)核，可以增溶水、蛋白質(zhì)等極性

15、物質(zhì)。近年來，該技術(shù)和其他方法結(jié)合，如親和配體的引入、超臨界流體萃取技術(shù)的聯(lián)用以及分離萃取工藝設(shè)備的完善，大大提高了目標物的萃取率和分離的選擇性，拓展了該技術(shù)的應(yīng)用空間，可以預見它在海洋微生物生物活性產(chǎn)物方面的研究和開發(fā)及海洋生物制藥方面有良好的應(yīng)用潛力。膜分離技術(shù)膜分離是用天然或人工合成的高分子薄膜以外界能量或化學位差為推動力，對雙組分或多組分的溶質(zhì)進行分離、分級、提純和濃縮的過程。膜分離過程在常溫、無相變、無化學變化條件下實現(xiàn)對物質(zhì)的分離，是一項有效、節(jié)能、無污染、保持原料性能不變的物質(zhì)分離技術(shù)。近年來，微濾、超濾及反滲透等各種膜分離技術(shù)發(fā)展迅速，以廣泛應(yīng)用于制藥、生物化工、食品、環(huán)保等方

16、面，在天然活性物質(zhì)的提取和海洋藥物的研制中更顯現(xiàn)出其技術(shù)優(yōu)勢。納濾納濾膜是世紀年代末問世的一種新型分離膜，其截留分子量介于反滲透和超濾膜之間。該膜存在著納米級細孔，截留率大于的最小分子的直徑約為。與反滲透和超濾等膜分離過程一樣，納濾也是以壓力差為推動力的膜分離，其分離機理可以運用電荷模型、細孔模型及靜電排斥和立體阻礙模型等來描述。利用納濾膜的電荷性，可以用來分離肽類活性物質(zhì)。多肽分子含有游離的羧基和氨基，等電點時呈電中性，當溶液的值高于或低于等電點時，多肽分子則呈陰離子或陽離子形式，帶有相應(yīng)的正電荷或負電荷。利用帶有靜電官能基團的納濾膜，只要通過調(diào)節(jié)溶液的，就可以截留離子而不截留電中性的分子。

17、此特性可以分離分子量幾乎相差無幾，但等電點相差較大的多肽混合體系。同時選擇適合的納濾膜還可以從低聚糖混合溶液中有效的除去單糖、二糖等。親和一膜過濾親和一膜過濾是生物分子的親和相互作用原理與膜分離技術(shù)相結(jié)合的新型耦合分離技術(shù)。當需提純物質(zhì)（親和體）自由存在于提取液時，由于其分子量相對比較小，能順利地通過截留相對分子量大的超濾膜。但當親合體與具有結(jié)合能力的大分子配體混合形成親和體大分子復合物后，由于此復合體的分子量遠大于超濾膜的截留相對分子量，從而被截留，而提取液中其他未被結(jié)合的組分則通過超濾膜被除去。用適合的洗脫液處理超濾膜截流到的復合物，使得親和膜過濾法既具有膜分離法易于放大、分離速度快的特點

18、，又具有親和層析選擇性好、分離精度高的優(yōu)點，在篩選分離純化濃縮功能性蛋白質(zhì)分子（酶、抗體、抗原、載體、抗生素等）有較大的應(yīng)用前景。色譜方法色譜方法的起源、發(fā)展與天然產(chǎn)物的研究工作密切相關(guān)。海洋微生物活性成分多而結(jié)構(gòu)復雜，有效成分的分離、純化很困難，而色譜分離技術(shù)則是這類物質(zhì)精細分離的有效手段。液相色譜液相色譜法作為一種分離手段，是根據(jù)混合物種不同組分在流動相和固定相間具有不同的分配系數(shù)，當兩相做相對運動時，這些組分在麗項間進行反復多次的分配，從而得到分離。液相色譜分離法是海洋天然活性物質(zhì)蛋白質(zhì)、多肽、多糖、低聚糖、核苷酸等的分離純化的重要方法。特別是制備性高效液相色譜技術(shù)的出現(xiàn)，對海洋生物制藥

19、產(chǎn)生了深遠的影響，它不僅可以在溫和條件下段時間內(nèi)達到分離目的，更重要的是易于放大，能形成生產(chǎn)化的制備規(guī)模。液相色譜可按溶質(zhì)在兩相分離過程的物理化學原理分類：）吸附色譜：用固體吸附劑作固定相，以不同的溶劑作流動相，依據(jù)樣品中各組分在吸附劑上吸附性能的差別來實現(xiàn)分離。）分配色譜：用在固相基體上的固定液作固定相，以不同極性溶劑作流動相，依據(jù)樣品中各組分在固定液上分配性能的差別來實現(xiàn)分離。）離子色譜：用高效微粒離子交換劑作固定相，以具有一定值的緩沖溶液作流動相，依據(jù)離子型化合物中各離子組分與離子交換劑上表面帶電荷基團進行可逆性離子交換能力的差別而實現(xiàn)分離。）體積排阻色譜：用化學惰性的多孔性凝膠作固定相

20、，按固定相對樣品中各組分分子體積阻滯作用的差別來實現(xiàn)分離。）親和色譜：以在不同基體上，鍵合多種不同特征的配體作固定相，用不同的值緩沖溶液作流動相，依據(jù)生物分子與基體上鍵聯(lián)的配位體之間存在的特異性親和作用能力的差別，而實現(xiàn)對具有生物活性的生物分子的分離。高速逆流色譜逆流色譜是一種無載體的液一液分配色譜，從古老的分液漏斗萃取法發(fā)展而來，有著回收率高、制備量大、排除載體干擾的優(yōu)點。超臨界流體色譜超臨界流體色譜以超臨界流體為流動相，必要時加入甲醇等極性物質(zhì)為改性劑來改善分離性能。超臨界流體色譜具有氣相色譜和高效液相色譜的優(yōu)點，在室溫下即可分離熱不穩(wěn)定性、沸點較高或分子量較大的物質(zhì)，同時還具有柱效高、分

21、離速度快的特點，可用通用的靈敏檢測器。結(jié)語世紀是海洋的世紀，海洋是人類生命的巨大寶庫。在過去的幾十年中，人們已經(jīng)從海洋環(huán)境中分離到數(shù)百種具有生理活性的化合物，其中很多屬海洋環(huán)境特有的成分。然而我們對海洋微生物的研究和開發(fā)還剛剛起步，關(guān)于海洋微生物的生理結(jié)構(gòu)、生活特點、代謝調(diào)控各方面還很不清楚，嚴重制約了人們對海洋財富的開發(fā)和利用。隨著化學、生物、物理、制藥等相關(guān)學科的發(fā)展和相互滲透，天然產(chǎn)物的分離提取技術(shù)的長足進步，對海洋微生物生物活性代謝產(chǎn)物的分離提取和研究提供更強有力的技術(shù)支持。參考文獻，：，鷗，：李越中，陳琦海洋微生物資源多樣性生物工程進展，。：鮑元興，韓亮，孫蔚榕低聚糖的納濾分離技術(shù)食品工業(yè)，（）：葉玫，吳成業(yè)，莊宛海洋生物活性物質(zhì)的分離提取技術(shù)進展福建水產(chǎn)，（）：謝苗，鐘劍霞海藻多糖的藥用功能與展望中國藥學雜志，（）：黃建設(shè)，龍麗娟海洋天然產(chǎn)物及其生理活性的研究進展海洋通報，（）：李利君，蔡慧