細胞免疫熒光技術課件

1、細胞免疫熒光技術細胞免疫熒光技術 原位檢測原位檢測 抗原抗體特異反應抗原抗體特異反應 間接法間接法 間接熒光抗體染色法示意圖抗原抗原抗體抗體熒光素標記熒光素標記的抗抗體的抗抗體激發(fā)光激發(fā)光顯示熒光顯示熒光Hela細胞細胞Vinculin實驗用品實驗用品試劑：試劑：固定液：固定液：4%PFA細胞通透：細胞通透：0.2%TritonX封閉試劑：封閉試劑：10%正常山羊血清正常山羊血清一抗：小鼠源抗一抗：小鼠源抗Vinculin單克隆抗體單克隆抗體二抗二抗:Alexa Fluor555標記的山羊抗小鼠標記的山羊抗小鼠IgGDAPI（4,6-二脒基二脒基-2-苯基吲哚）苯基吲哚）PBS洗滌緩沖液：洗滌

2、緩沖液：PH7.4材料：材料：Hela細胞細胞細胞培養(yǎng)皿細胞培養(yǎng)皿儀器：儀器：熒光顯微鏡熒光顯微鏡將細胞鋪在將細胞鋪在24孔板中孔板中將細胞培養(yǎng)將細胞培養(yǎng)至所需密度至所需密度加入加入4%PFA固定固定10min染色染色或保存或保存PBS洗洗滌滌PBS洗洗滌滌0.2%TritonX處理處理5min 封閉封閉室溫室溫30min4過夜過夜371-2小時小時375-10min熒光顯微鏡熒光顯微鏡觀察觀察加入一抗加入一抗加入二抗加入二抗加入加入DAPI復染復染PBS洗滌洗滌PBS洗滌洗滌PBS洗滌洗滌三，觀三，觀察察humanHeLacells 細胞不要鋪的過密細胞不要鋪的過密:60-70% 防止細胞污

3、染防止細胞污染 固定時間不要太長固定時間不要太長,一般一般10-30minTrionX處理時間不宜過長，膜蛋白可不必處理處理時間不宜過長，膜蛋白可不必處理 選擇合適的封閉液選擇合適的封閉液 二抗孵育后二抗孵育后,一定要洗干凈一定要洗干凈 必要時用恒溫搖床搖洗必要時用恒溫搖床搖洗 1. 1. 免疫熒光技術免疫熒光技術 2. 2. 免疫酶技術免疫酶技術 3. 3. 免疫親和技術免疫親和技術 4. 4. 膠體金技術膠體金技術 標記物標記物 使抗體或抗原使抗體或抗原 抗體復合物在抗體復合物在 各種顯微鏡下各種顯微鏡下 可見的物質可見的物質免疫細胞化學技術免疫細胞化學技術 選擇合適的方法選擇合適的方法

4、材料要留好材料要留好 選擇抗體選擇抗體 選擇標記酶選擇標記酶 封閉液的選擇封閉液的選擇 設定對照實驗設定對照實驗思考題思考題檢測檢測Hela細胞中蛋白細胞中蛋白A定位情況，思考應選擇什么方法，定位情況，思考應選擇什么方法，用什么儀器觀察？用什么儀器觀察？A可能的原因可能的原因 無抗原無抗原 抗體失效抗體失效 固定不充分固定不充分 過度固定過度固定 抗原修復無效抗原修復無效 不兼容的二抗和一抗不兼容的二抗和一抗 漏用試劑或未按正確的順序漏用試劑或未按正確的順序 加入試劑加入試劑相應的措施相應的措施 用原位雜交方法檢測蛋白表達用原位雜交方法檢測蛋白表達 按說明書儲存抗體按說明書儲存抗體;分裝抗體分

5、裝抗體;避免反復凍融避免反復凍融 增加固定時間或改用不同的固定劑增加固定時間或改用不同的固定劑 減少固定時間減少固定時間;抗原修復抗原修復 增加修復時間或更換修復液增加修復時間或更換修復液 使用可以與一抗結合的二抗使用可以與一抗結合的二抗 重復染色并確定使用的試劑和加入的順序重復染色并確定使用的試劑和加入的順序可能的原因可能的原因 一抗或二抗的濃度過高一抗或二抗的濃度過高 一抗和一抗和/或二抗與組織的或二抗與組織的 非特異性結合非特異性結合 組織過于干燥組織過于干燥 試劑粘附在舊的試劑粘附在舊的 或未制備好的玻片上或未制備好的玻片上相應的措施相應的措施預實驗摸索最佳濃度預實驗摸索最佳濃度一抗孵

6、育前封閉一抗孵育前封閉 (最好是二抗來源的血清最好是二抗來源的血清)在染色過程中避免組織干燥在染色過程中避免組織干燥用新鮮制備或購買的玻片進行實驗用新鮮制備或購買的玻片進行實驗可能的原因可能的原因 抗原修復方法過于劇烈抗原修復方法過于劇烈 組織切片從玻片上脫落組織切片從玻片上脫落 組織切片撕裂或褶皺組織切片撕裂或褶皺,切片下有氣泡切片下有氣泡 組織形態(tài)難以分辨組織形態(tài)難以分辨 組織固定不充分組織固定不充分,自發(fā)裂解自發(fā)裂解相應的措施相應的措施 預實驗摸索合適的修復條件預實驗摸索合適的修復條件 增加固定時間增加固定時間;烤片烤片; 使用新鮮準備的帶有充足電荷的玻片使用新鮮準備的帶有充足電荷的玻片 使用鋒利的刀片使用鋒利的刀片;分析時避開受損的區(qū)域分析時避開受損的區(qū)域 切片薄一些切片薄一些;冰凍過程形成冰晶冰凍過程形成冰晶,蔗糖脫水蔗糖脫水 及時固定及時固定;增加固定時間增加固定時間; 提高固定劑提高固定劑/組織的比例組織的比例; 將組織切得較小將組織切得較小可能的原因可能的原因 固定方法對于抗原不合適固定方法對于抗原不合適 抗原修復方法不合適抗原修復方法不合適 沒有及時固定引起抗原的擴散沒有及時固定引起抗原的擴散相應的措施相應的措