AS中性蛋白酶生產(chǎn)條件的優(yōu)化及活力的測定

1、實驗四 AS1.398 中性蛋白酶生產(chǎn)條件的優(yōu)化及其活力的測定一、目的1、熟悉微生物酶制劑的生產(chǎn)過程2、掌握酶活力的檢測方法3、掌握確定最佳培養(yǎng)條件的方法二、原理中性蛋白酶為水解酶的一種，可以將蛋白質(zhì)水解成為氨基酸，是我國蛋白酶產(chǎn)量 最大的酶制劑品種，主要應(yīng)用于皮革加工工業(yè)和食品工業(yè)。本實驗使用枯草桿菌AS1.398在實驗室中模擬發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶酶制劑過程，確定以玉米粉、豆餅粉等為 碳源氮源的培養(yǎng)基配方等最佳產(chǎn)酶條件。三、主要儀器和材料（1） 搖床、培養(yǎng)箱、冰箱、滅菌鍋、超凈工作臺、低速離心機、 722-2000 分光光度計、 1/100 天平、水浴鍋、電熱爐。 枯草桿菌AS1.398、葡萄

2、糖、玉米粉、豆?jié){、牛肉膏、蛋白胨、稀鹽酸、氫氧化鈉、 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（100卩g/mL, 0.2 mol/L 鹽酸配制）、2%各素（用pH=7.5磷酸緩沖 液溶解）、 0.4mol/L 三氯乙酸、碳酸鈉溶液（ 0.4mol/L ）、 folin- 酚試劑（ 1N）。四、操作步驟一）培養(yǎng)基的制備及滅菌1、 液體細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨 1%，氯化鈉 0.5%，調(diào)節(jié) pH7.2-7.4 滅菌：115C, 30分鐘。2、搖瓶培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KHPQ 1.0g , Na 2HPO2.O g , MgSO 4 7H2O 0.8g , 牛肉膏 0.7g （每 1000ml）。碳源：玉米粉 4%

3、，葡萄糖 2%，氮源：豆?jié){ 3%， 4%（二）培養(yǎng)1、 菌種活化：取保存枯草桿菌斜面，轉(zhuǎn)接于空白斜面上，37r培養(yǎng)36h。2、菌種一級擴大培養(yǎng)：取一環(huán)菌種接于裝有 100ml 液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的 250ml 的三角瓶中，37T培養(yǎng)48小時。3、 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：取1ml菌液分別接于A （牛肉膏蛋白胨）、B （葡萄糖2%豆?jié){3%、 C （葡萄糖2% 豆?jié){4%、D （玉米粉4%，豆?jié){3%、E （玉米粉4%，豆?jié){4% 液 體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH值為7.4，37C、240r/min培養(yǎng)36h。（三、酶活力的測定：1、 發(fā)酵液離心：1200r/min離心20min，取上清酶液 A、B、C、D

4、 E。2、不同培 養(yǎng)基 的酶活力測定 ：樣品：取5只小試管，分別加入1 mLA B、C、D E酶液（先于40C水浴中預(yù)熱3 分鐘），每個三角瓶中再加入1 mL酪蛋白溶液（先40C預(yù)熱3分鐘），搖勻，在 40°C水浴中精確反應(yīng)10min，立刻加入3mL三氯醋酸，搖動，靜置10min，濾紙 過濾，用小試管收集濾液，放置10mi n。另取5只10mL具塞刻度試管，分別加入1.0mLA、B C D E過濾液、每管 再依次加入 5ml 0.4M NazCQ 1.0mL folin- 酚試劑，搖勻，40C水浴20min，冷 去卩，680nm波長比色?？瞻祝喝?只小試管，分別加入1mLA B CD

5、 E酶液、每管再加入3mL三氯醋 酸，混合后加入1mL酪蛋白，振蕩，過濾，收集濾液。另取5只10mL具塞刻度試管，分別加入1.0mL上述過濾液，每管再依次加入5ml 0.4M NazCO、1.0mL folin- 酚試劑，搖勻，40C水浴 20min。3、酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取8只小試管，按下表操作。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，做出回歸方程。編號1#2#3#4#5#6#7#空白標(biāo)準(zhǔn)溶液ml0.10.20.30.40.50.60.700.2M HCI ml0.90.80.70.60.50.40.31.00.4M Na 283ml5.05.05.05.05.05.05.05.0Folin 液 ml1.01.0

6、1.01.01.01.01.01.040 C水浴，20min冷卻680nm波長比色標(biāo)準(zhǔn)液卩g10203040506070OD0.1090.2140.3200.4390.5200.6130.7082Y=0.01067+0.01013xR2=0.99767五、結(jié)果處理以40C、pH7.2條件下，粗酶液分解酪素每分鐘產(chǎn)生1他酪氨酸定義為一個酶活力 單位。匯總?cè)鄶?shù)據(jù)，比較各培養(yǎng)基的優(yōu)劣。1每升發(fā)酵液酶活力單位數(shù)=0D K 5 1000 /10（ K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的倒數(shù)）=K OD 5 102六、實驗分組每組5人，每班6組。附表1實驗試劑實驗試劑用量實驗試劑用量酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（500舊/mL）每班100mL0.2M HCl每組10mL1%酪素（pH7.2磷酸緩沖溶液）每組100mL0.4M Na2CO3每組100mL三氯乙酸每組100mLfolin-酚試劑每組20mL附表2實驗玻璃儀器實驗玻璃儀器用量實驗玻璃儀器用量250mL三角瓶（做棉塞）5個/組大離心管5個/組玻棒、100mL、250mL燒杯各1個/組50mL具