報告載體及報告基因總結(jié)

1、報告基因載體(1) 報告基因載體的特點：除了具有表達蛋白質(zhì)所需要的結(jié)構(gòu)外，理想的報告基因載體本身無調(diào)節(jié)結(jié)合位點或序列，而具有有意插入的調(diào)節(jié)結(jié)合位點，盡管可以從報告基因載體除去已知的結(jié)合位點， 減少報告基因上游的轉(zhuǎn)錄，但從幾千kb的DNA中去除所有潛在的調(diào)控序列是不可能的。因此在使用報告基因載體時，應(yīng)使用合適的對照載體。報告基因質(zhì)粒載體一般在大腸桿菌中繁殖，因此包括一個 DNA復(fù)制起始點(ori)和基因篩選標記，通常為氨芐西林抗性基因(Ampr)。另外還具有絲狀噬菌體復(fù)制起始點(flori)，可使載體形成單鏈DNA，便于基因突變和測序。報告基因和側(cè)翼區(qū)：報告基因編碼區(qū)和側(cè)翼區(qū)常被改變。例如，去除

2、SEAP(分泌型堿性磷酸酶)羧基末端 24個氨基酸，使SEAP能直接分泌到細胞外，因此測定SEAP活性不必裂解細胞。去除熒光素酶的過氧化物酶體靶向序列，使熒光素酶轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)而非過氧化物酶體中。為了使報告基因表達最大化，核糖體最佳結(jié)合序列(GCCGCCCCAT被置于報告基因的5'端。此序列能增加翻譯效率，產(chǎn)生Ncol酶切位點，可使外源基因 N末端與報告基因融合。(3) 多克隆位點：許多報告基因含有2個以上克隆位點(MCS), 個位于報告基因上游，用于插入假定的克隆啟動子或增強子/啟動子區(qū)；另一個位于其他位置，用于插入克隆調(diào)控元件，例如插入可遠距離發(fā)揮作用的增強子。另外，還有用于插入基因

3、篩選標記的克隆位點， 用于篩選穩(wěn)定表達報告基因的宿主細胞。MGS具有幾個單酶切位點，用限制性內(nèi)切酶催化可產(chǎn)生黏性末端。DNA片段可插到此位點。 MCS還包括一個或兩個 MCS末端，此末端序列可由限制性內(nèi)切酶催化斷裂形成3'懸垂末端，可用核酸外切酶川進行嵌套缺失分析。(4) 多聚腺苷酸信號：多聚腺苷酸(polyA)可增強哺乳細胞 mRNA穩(wěn)定性和mRNA的翻譯。 polyA序列緊隨報告基因之后，可指導(dǎo) RNA轉(zhuǎn)錄物3'端添加200250個腺苷酸殘基。在 轉(zhuǎn)錄單位5 '端插入polyA信號能降低源于載體的隱匿啟動子序列基因表達水平，去除背景表達，增加報告基因系統(tǒng)的靈敏性。在

4、報告基因轉(zhuǎn)錄單位上游 3個閱讀框中均插入終止密碼子，可進一步降低源于載體的假轉(zhuǎn)錄背景。常見的報告基因報告基因必須具備的特點：由原核基因編碼的基因產(chǎn)物必須與同轉(zhuǎn)染前真核細胞內(nèi)任何相似的產(chǎn)物相區(qū)別； 細胞內(nèi)其他基因產(chǎn)物不會于擾報告基因產(chǎn)物的檢測；報告基因編碼產(chǎn)物的檢測應(yīng)該快速、簡便、靈敏度高，而且重現(xiàn)性好。到目前為止，報告基因通常是在報告基因載體質(zhì)粒中與被檢測基因序列相連，先讓質(zhì) 粒在大腸桿菌中進行增殖，再提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人感興趣的真核細胞中。與此同時，還要將 有真核啟動子和增強子的另一種報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染同一細胞，作為轉(zhuǎn)染率的內(nèi)對照。(1)氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)該報告基因來源于大腸桿菌轉(zhuǎn)位子

5、9,是第1個用于檢測細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性的報告基因。氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶可催化乙酰CoA的乙?；D(zhuǎn)移到氯霉素 3羥基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳細胞無內(nèi)源性表達，性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期較短，適于瞬時表達研究。可用同位素、熒光 素和酶聯(lián)免疫吸附測定 (enzyme linkedimmunosorbantassay ， ELISA檢測其活性，也可進行 蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)和免疫組織化學(xué)分析。CAT與其他報告基因相比，線性范圍較窄， 靈敏性較低。(2) 3半乳糖苷酶：3半乳糖苷酶由大腸桿菌lacZ基因編碼，可催化半乳糖苷水解。最大優(yōu)勢是易于用免疫組織化學(xué)法觀測其原位表達，是最常用的監(jiān)測轉(zhuǎn)

6、染率的報道基因之一。以鄰一硝基苯一3 D半乳吡喃糖苷(ONPG)為底物可用標準的比色法檢測酶活性，其檢測動力學(xué)范圍為6個數(shù)量級。氯酚紅一3 D半乳吡喃糖苷(CPRG是另一個可用比色法檢測 酶活性的底物，其靈敏度比ONPG高近10倍。以MUG和熒光素二半乳糖苷(FDG)為底物則可用熒光法檢測其活性。此法可檢測單個細胞的酶活性，并可用于流式細胞學(xué)(FACS分析。如以二氧雜環(huán)丁烷為底物，可用化學(xué)發(fā)光法檢測酶活性，其檢測動力學(xué)范圍最大，靈敏度最高，與用生物發(fā)光法檢測熒光素酶活性的靈敏度相似。(3) 熒光素酶：熒光素酶是能夠催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶，哺乳細胞無內(nèi)源性熒光素酶。最常用的熒光素酶有細菌熒

7、光素酶、螢火蟲熒光素酶和Ren ilia熒光素酶。細菌熒光素酶對熱敏感，因此在哺乳細胞的應(yīng)用中受到限制。螢火蟲熒光素酶靈敏度高，檢測線性范圍寬達78個數(shù)量級，是最常用于哺乳細胞的報道基因，用熒光比色計即可檢測酶活性，因而適用于高通量篩選。隨著具有膜通透性和光裂解作用的螢火蟲熒光素酶的應(yīng)用，無需裂解細胞即可檢測酶活性。Reni Ila熒光素酶催化腸腔素(coele nteraz ine)氧化，產(chǎn)物可透過生物膜，可能是最適用于活細胞的報告分子。將熒光素酶報告基因載體轉(zhuǎn)染到細胞中，可用熒光素酶檢測系統(tǒng)靈敏方便地測定熒光素酶基因的表達。自1986年起，螢火蟲熒光素酶基因被用作測定基因表達的報告基因，獲

8、得了廣泛的應(yīng)用。Promega公司的pGL3及pGL2系列載體，含SV40啟動子及增強子的不同組合，有助于分析DNA片段的轉(zhuǎn)錄活性。熒光素酶報告基因有許多優(yōu)點：非放射性；比 CAT及其他報告基因速度快；比 CAT靈敏100倍；熒光素酶在哺乳細胞中的半衰期為3小時，在植物中的半衰期為3. 5小時。由于半衰期短，故啟動子的改變會即時導(dǎo)致熒光素酶活性的改變，而熒光素酶不會積累。相反，CAT在哺乳細胞中的半衰期為50小時。熒光素酶濃度在 1016mol / L(1OpS/ L)到10-8mol / L(1mg/L)范圍內(nèi)，熒光信號強度與酶濃度成正比。在理想條件下，可檢測到 I0-20mol / L的熒

9、光素酶。Promega公司的熒光素酶檢測系統(tǒng)比一般的方法靈敏及簡單，產(chǎn) 生的光穩(wěn)定。分泌型堿性磷酸酶(SEAP) SEAP是人胎盤堿性磷酸酶的突變體，無內(nèi)源性表達。SEAP缺乏胎盤堿性磷酸酶羧基末端的24個氨基酸。其優(yōu)點是無需裂解細胞，只用培養(yǎng)介質(zhì)即可檢測酶活性，便于進行時效反應(yīng)試驗。以間硝基苯磷酸鹽(PNPP為底物時可用標準的比色法 測定酶活性，操作簡單，反應(yīng)時間短，價格廉價，但靈敏度低。以黃素腺嘌呤二核苷酸磷酸 為底物進行比色測定，其靈敏度增高。SEAF可催化D熒光素一O磷酸鹽水解生成 D-熒光素，后者又可作為熒光素酶的底物，此即兩步生物發(fā)光法檢測酶活性的原理。此方法靈敏度高，接近于熒光素

10、酶報告基因的檢測。還可用一步化學(xué)發(fā)光法檢測酶活性。(5) 熒光蛋白家族：熒光蛋白家族是從水螅綱和珊瑚類動物中發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)量 為20 00030 000的同源蛋白。綠色熒光蛋白 (GFP)是應(yīng)用最多的發(fā)光蛋白。GFP存在于發(fā)光水母(AequoreaVictoria)中。用395 Bin的紫外線和475 nm的藍光激發(fā)，GFP可在508nm處 自行發(fā)射綠色熒光，無需輔助因子和底物。GFP最大的優(yōu)勢是無需損傷細胞即可研究細胞內(nèi)事件。1991年克隆了 GFP基因，目前已獲得幾個突變體，如“紅色遷移”突變體(red shiftmutant)，其熒光更強。其他突變體還有藍色熒光蛋白(BFP)增強型GFP(EGFP和去穩(wěn)定EGFP(destabilizedEGFP等。紅色熒光蛋白 (RF