細(xì)胞融合與單克隆抗體ppt課件

1、第三章第三章 細(xì)胞交融與單克隆抗體細(xì)胞交融與單克隆抗體3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)定義定義: :在離體條件下用人工的方法把不同種的細(xì)胞經(jīng)過無在離體條件下用人工的方法把不同種的細(xì)胞經(jīng)過無 性方式交融成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。性方式交融成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。3.1.13.1.1細(xì)胞交融的開展歷史細(xì)胞交融的開展歷史“自發(fā)細(xì)胞交融景象：自發(fā)細(xì)胞交融景象：18381838年年 Muller Muller 多核的腫瘤細(xì)胞多核的腫瘤細(xì)胞18581858年年 Virchow Virchow 正常組織、發(fā)炎組織及腫正常組織、發(fā)炎組織及腫 瘤組織瘤組織多核細(xì)胞多核細(xì)胞18731873年年 Lug

2、inbuhl Luginbuhl 天花病人天花病人多核體血細(xì)胞多核體血細(xì)胞18751875年年 Lange Lange 蛙類血液細(xì)胞發(fā)生合并蛙類血液細(xì)胞發(fā)生合并3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)重要事件重要事件v19621962年年,(,(日日) )岡田善雄岡田善雄 仙臺(tái)病毒促細(xì)胞交融仙臺(tái)病毒促細(xì)胞交融v 70 70年代年代,(,(華裔加籍華裔加籍) )高國楠高國楠 PEG PEG促植物原生促植物原生v 質(zhì)體的交融質(zhì)體的交融v 80 80年代，電交融年代，電交融3.1 細(xì)胞交融細(xì)

3、胞交融(cell fusion)植物細(xì)胞交融：植物細(xì)胞交融： 19721972年美年美P.S.CarlsonP.S.Carlson雜種煙草雜種煙草現(xiàn)代植物細(xì)胞交融的開場現(xiàn)代植物細(xì)胞交融的開場 19781978年德梅歇爾斯年德梅歇爾斯“pomoto“pomoto3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)“Pomoto “Pomoto 3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion) 3.1.2 植物原生質(zhì)體培育與細(xì)胞交融植物原生質(zhì)體培育與細(xì)胞交融 (Protoplast and Cell fusion)植物原生質(zhì)體培育植物原生質(zhì)體培育植物細(xì)胞交融植物細(xì)胞交融3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(c

4、ell fusion)3.1.3 3.1.3 動(dòng)物細(xì)胞交融動(dòng)物細(xì)胞交融 動(dòng)物細(xì)胞交融是研討細(xì)動(dòng)物細(xì)胞交融是研討細(xì)胞遺傳信息轉(zhuǎn)移，基因胞遺傳信息轉(zhuǎn)移，基因在染色體上的定位以及在染色體上的定位以及發(fā)明新細(xì)胞株的有效途發(fā)明新細(xì)胞株的有效途徑。徑。3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的交融腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的交融3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)人纖維肉瘤細(xì)胞與小鼠畸胎瘤細(xì)胞交融人纖維肉瘤細(xì)胞與小鼠畸胎瘤細(xì)胞交融1978年年(瑞士瑞士)埃勒門斯埃勒門斯 (美國美國)柯路斯柯路斯3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融

5、(cell fusion)3.1.4 3.1.4 細(xì)胞交融的誘導(dǎo)細(xì)胞交融的誘導(dǎo)誘導(dǎo)交融的方法誘導(dǎo)交融的方法: :物理法物理法: :電場刺激電場刺激 激光激光 顯微操作顯微操作 化學(xué)法化學(xué)法: :聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)結(jié)合高結(jié)合高pHpH、 高鈣離子法高鈣離子法生物法生物法: :仙臺(tái)病毒仙臺(tái)病毒3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)不同細(xì)胞交融的條件及其主要運(yùn)用不同細(xì)胞交融的條件及其主要運(yùn)用來來 源源前處理前處理融合方法融合方法主要應(yīng)用主要應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞不需不需仙臺(tái)病毒、仙臺(tái)病毒、PEGPEG、電融合電融合生產(chǎn)單克隆生產(chǎn)單克隆抗體抗體植物細(xì)胞植物細(xì)胞脫壁脫壁PEG

6、PEG、電融合、電融合創(chuàng)造植物新創(chuàng)造植物新品種品種微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞脫壁脫壁PEGPEG高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種菌種3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)仙臺(tái)病毒仙臺(tái)病毒(Sendal virus)(Sendal virus)也稱日本血凝病毒也稱日本血凝病毒HVJHVJ，屬粘病毒副流感類群，是，屬粘病毒副流感類群，是RNARNA病病毒，多型顆粒狀，易在小鼠中蔓延。毒，多型顆粒狀，易在小鼠中蔓延。 3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)交融的能夠機(jī)制：交融的能夠機(jī)制： 病毒被膜含有糖蛋白，其外表還分布有許多具有神經(jīng)氨酸病毒被膜含有糖蛋白，其外表還

7、分布有許多具有神經(jīng)氨酸酶和凝血活性的突起，神經(jīng)氨酸酶可降解細(xì)胞膜上的糖蛋酶和凝血活性的突起，神經(jīng)氨酸酶可降解細(xì)胞膜上的糖蛋白，使細(xì)胞膜部分凝集，再經(jīng)過膜上蛋白質(zhì)分子的重新分白，使細(xì)胞膜部分凝集，再經(jīng)過膜上蛋白質(zhì)分子的重新分布，使膜中的脂類分子重排，而翻開質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞交融。布，使膜中的脂類分子重排，而翻開質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞交融。3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)交融過程：交融過程：1. 1. 病毒顆粒附著細(xì)胞膜上起搭橋作用，使細(xì)胞病毒顆粒附著細(xì)胞膜上起搭橋作用，使細(xì)胞 粘著成堆，在粘著成堆，在44冰浴中細(xì)胞嚴(yán)密接近，但不冰浴中細(xì)胞嚴(yán)密接近，但不 發(fā)生交融。發(fā)生交融。2. 37 2.

8、 37 溫浴后，粘結(jié)部位的細(xì)胞膜破壞，構(gòu)成溫浴后，粘結(jié)部位的細(xì)胞膜破壞，構(gòu)成 通道，細(xì)胞質(zhì)流通、融匯。通道，細(xì)胞質(zhì)流通、融匯。3. 3. 病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)兩個(gè)細(xì)胞合并、病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)兩個(gè)細(xì)胞合并、 變圓，完成交融，全過程約變圓，完成交融，全過程約15153030分鐘。分鐘。4. 4. 細(xì)胞核也相互合并細(xì)胞核也相互合并, ,完成細(xì)胞交融完成細(xì)胞交融3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)PEGPEG誘導(dǎo)誘導(dǎo)PEGPEG聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol) (polyethylene glycol)

9、 商品名：卡波蠟商品名：卡波蠟(carbowax)(carbowax)多聚化合物，分子式多聚化合物，分子式H(OCH2CH2)nOHH(OCH2CH2)nOH實(shí)驗(yàn)室用實(shí)驗(yàn)室用PEGPEG平均分子量在平均分子量在20020020,00020,000普通：普通：1,0001,000 1,000固體固體常用分子量：常用分子量：40006000400060003.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)交融的能夠機(jī)制交融的能夠機(jī)制？脫水作用能使細(xì)胞凝聚，并使膜構(gòu)造發(fā)生？脫水作用能使細(xì)胞凝聚，并使膜構(gòu)造發(fā)生 變化變化？改動(dòng)膜外表電荷或膜電位，而導(dǎo)致膜上蛋？改動(dòng)膜外表電荷或膜電位，而導(dǎo)致膜上蛋 白質(zhì)

10、顆粒聚集及膜脂分子隨之發(fā)生重排之白質(zhì)顆粒聚集及膜脂分子隨之發(fā)生重排之 故。故。 ？3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)初步分析初步分析 能夠是由于帶有大量負(fù)電荷的能夠是由于帶有大量負(fù)電荷的PEGPEG分子和原生質(zhì)體外表分子和原生質(zhì)體外表的負(fù)電荷間，在鈣離子的銜接下構(gòu)成靜電鍵，促使異的負(fù)電荷間，在鈣離子的銜接下構(gòu)成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合，在高源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合，在高pHpH、高鈣離子溶、高鈣離子溶液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEGPEG分子洗脫，分子洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)

11、并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負(fù)電荷銜接起來，進(jìn)而構(gòu)成具有共同質(zhì)膜的交融體。正負(fù)電荷銜接起來，進(jìn)而構(gòu)成具有共同質(zhì)膜的交融體。3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)PEGPEG誘導(dǎo)過程本卷須知：誘導(dǎo)過程本卷須知： 控制與分子量、濃度和處置時(shí)間控制與分子量、濃度和處置時(shí)間懸浮法：將細(xì)胞懸于懸浮法：將細(xì)胞懸于40405050的的PEG4000PEG4000進(jìn)展進(jìn)展 溶，處置溶，處置1 12 2分鐘為宜。分鐘為宜。離心法：先將細(xì)胞混合物懸于離心法：先將細(xì)胞混合物懸于30304040的的 PEG4000 PEG4000，再離心進(jìn)展交融，那么可適，再離心進(jìn)展交融，那么可適 當(dāng)延伸交融時(shí)間，以

12、當(dāng)延伸交融時(shí)間，以5 58 8分鐘為宜。分鐘為宜。 3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)PEGPEG誘導(dǎo)本卷須知：誘導(dǎo)本卷須知：lpHpH值以值以pH7.4pH7.48.08.0為宜，或略偏堿性為宜，或略偏堿性pH8.0pH8.08.28.2。l 輔以輔以5 51515的的DMSODMSO或在交融前用或在交融前用PHAPHA處置一下，效處置一下，效l 果更好。果更好。3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)PEGPEG交融法優(yōu)點(diǎn)交融法優(yōu)點(diǎn) 效率高效率高 資料方便，操作簡易資料方便，操作簡易 效果穩(wěn)定效果穩(wěn)定PEGPEG交融法缺陷交融法缺陷 對(duì)細(xì)胞有毒性對(duì)細(xì)胞有毒性3.1

13、 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)物理電交融誘導(dǎo)物理電交融誘導(dǎo)機(jī)制機(jī)制在直流電脈沖的誘導(dǎo)下在直流電脈沖的誘導(dǎo)下, , 原生質(zhì)體質(zhì)膜外表原生質(zhì)體質(zhì)膜外表的電荷和氧化復(fù)原電位變化的電荷和氧化復(fù)原電位變化, , 使原生質(zhì)體粘使原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂, ,進(jìn)而質(zhì)膜開場銜接進(jìn)而質(zhì)膜開場銜接, ,直到閉合成完好的細(xì)胞交融體直到閉合成完好的細(xì)胞交融體3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)電交融誘導(dǎo)法原理表示圖電交融誘導(dǎo)法原理表示圖3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)電交融優(yōu)點(diǎn)：電交融優(yōu)點(diǎn)：u交融

14、效率高，可達(dá)交融效率高，可達(dá)50508080u產(chǎn)生雜交細(xì)胞的頻率高，是產(chǎn)生雜交細(xì)胞的頻率高，是PEGPEG法的法的100100倍。倍。u u操作簡便、穩(wěn)定，但需設(shè)備。操作簡便、穩(wěn)定，但需設(shè)備。u對(duì)細(xì)胞無毒害作用。對(duì)細(xì)胞無毒害作用。u可在顯微鏡下察看操作?？稍陲@微鏡下察看操作。3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)交融率交融率交融細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)交融細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)視野內(nèi)全部細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)視野內(nèi)全部細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù) 100100交融率交融率= =3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)植物細(xì)胞交融根本過程植物細(xì)胞交融根本過程去除細(xì)胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體去除細(xì)胞壁以獲得大

15、量的原生質(zhì)體誘導(dǎo)細(xì)胞交融構(gòu)成雜種細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞交融構(gòu)成雜種細(xì)胞 細(xì)胞相互接近細(xì)胞相互接近 構(gòu)成細(xì)胞橋構(gòu)成細(xì)胞橋 最關(guān)鍵的一步最關(guān)鍵的一步 胞質(zhì)浸透胞質(zhì)浸透 細(xì)胞核交融細(xì)胞核交融挑選挑選, ,培育培育, ,促進(jìn)細(xì)胞分裂促進(jìn)細(xì)胞分裂, ,分化分化, ,從細(xì)胞團(tuán)從細(xì)胞團(tuán), ,愈傷組織到最后成株愈傷組織到最后成株3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)動(dòng)物細(xì)胞交融根本過程動(dòng)物細(xì)胞交融根本過程 動(dòng)物單個(gè)細(xì)胞的獲得動(dòng)物單個(gè)細(xì)胞的獲得組織的獲得組織的獲得組織的消化組織的消化 誘導(dǎo)細(xì)胞交融構(gòu)成雜種細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞交融構(gòu)成雜種細(xì)胞 挑選，培育挑選，培育3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)3.1

16、 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞交融的比較植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞交融的比較比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合的原理細(xì)胞融合的原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞膜的流動(dòng)性、植物細(xì)胞全能性植物細(xì)胞全能性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合的方法去處細(xì)胞壁后誘去處細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)方法物理（顯微操作、物理（顯微操作、電融合）電融合）化學(xué)（聚乙二醇）化學(xué)（聚乙二醇）物理、化學(xué)方法物理、化學(xué)方法（同左）（同左）滅活的病毒滅活的病毒用途用途獲得

17、雜種植株獲得雜種植株制備單克隆抗體制備單克隆抗體3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)影響細(xì)胞交融的要素影響細(xì)胞交融的要素 (1) (1) 親本細(xì)胞外表性質(zhì)，外表覆蓋絨毛而不規(guī)那么者較易親本細(xì)胞外表性質(zhì)，外表覆蓋絨毛而不規(guī)那么者較易融融 合；外表光滑者較難交融。合；外表光滑者較難交融。(2) (2) 細(xì)胞種類不同，交融效果不同，如腹水癌及株化細(xì)胞較易細(xì)胞種類不同，交融效果不同，如腹水癌及株化細(xì)胞較易 交融，而淋巴細(xì)胞或血球細(xì)胞幾乎不交融。交融，而淋巴細(xì)胞或血球細(xì)胞幾乎不交融。 (3) (3) 細(xì)胞交融時(shí)需求適宜溫度和運(yùn)動(dòng)形狀。如仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)歐細(xì)胞交融時(shí)需求適宜溫度和運(yùn)動(dòng)形狀。如仙臺(tái)

18、病毒誘導(dǎo)歐 利希氏腹水癌細(xì)胞交融時(shí)，于利希氏腹水癌細(xì)胞交融時(shí)，于37 37 振搖時(shí)易于交融，且振搖時(shí)易于交融，且 交融效率與病毒量呈正比。但在交融效率與病毒量呈正比。但在34 34 振搖那么交融率下振搖那么交融率下降。降。 在在3737時(shí)不振搖那么幾乎不交融。時(shí)不振搖那么幾乎不交融。 影響細(xì)胞交融影響細(xì)胞交融的要素的要素3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)(4)(4)細(xì)胞交融過程中，通常耗氧量較大缺氧時(shí)經(jīng)常不交融。細(xì)胞交融過程中，通常耗氧量較大缺氧時(shí)經(jīng)常不交融。空氣中含氧量大于空氣中含氧量大于2020時(shí)有一定交融率，但有些細(xì)胞在無氧時(shí)有一定交融率，但有些細(xì)胞在無氧條件下也可交融。

19、條件下也可交融。(5)(5)有些細(xì)胞交融時(shí)需求有些細(xì)胞交融時(shí)需求Ca2+Ca2+，否那么不交融，細(xì)胞蛋白質(zhì)亦發(fā)，否那么不交融，細(xì)胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生生 變化。實(shí)驗(yàn)闡明變化。實(shí)驗(yàn)闡明Sr2+Sr2+、Ba2+Ba2+、Mg2+Mg2+、Mn2+Mn2+等離子可替代等離子可替代 Ca2+ Ca2+但有效濃度較但有效濃度較Ca2+Ca2+大的多。交融時(shí)最適宜的離子強(qiáng)度大的多。交融時(shí)最適宜的離子強(qiáng)度 普通為普通為0.1mol/L0.1mol/L(6)(6)最適宜的最適宜的pHpH為為7 747478 8之間，在此范圍之外，交融率均較之間，在此范圍之外，交融率均較 低。低。3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell

20、fusion)交融細(xì)胞的特征及其意義交融細(xì)胞的特征及其意義 染色體組不穩(wěn)染色體組不穩(wěn)定，尤其種間定，尤其種間雜交細(xì)胞雜交細(xì)胞, ,培培育過程中染色育過程中染色領(lǐng)會(huì)逐漸喪失領(lǐng)會(huì)逐漸喪失 3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion) 實(shí)際研討實(shí)際研討基因定位和繪制基因圖任務(wù)中非常有用基因定位和繪制基因圖任務(wù)中非常有用 運(yùn)用價(jià)值運(yùn)用價(jià)值單克隆抗體單克隆抗體 植物育種植物育種3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)交融細(xì)胞類型交融細(xì)胞類型 同核體同核體homokaryonhomokaryon異核體異核體(heterokaryon(heterokaryon多核體多核體polykaryonpolykaryon異胞質(zhì)體異胞質(zhì)體(heterocybrid)(heterocybrid)3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion) 同核體(homokaryon)同源細(xì)胞的交融體。由于是同源細(xì)胞，它們的基因同源細(xì)胞的交融體。由于是同源細(xì)胞，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一樣。型及表現(xiàn)型完全一樣。3.1 細(xì)胞交融細(xì)胞交融(cell fusion)異核體異核體(heterokaryon)(heterokaryon) 非同源細(xì)胞的交融體。普通是親源關(guān)系較近的細(xì)胞，非同源細(xì)胞的交融體。普通是親源關(guān)