細(xì)胞冷凍保存技術(shù)課件

1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法之 細(xì)胞冷凍保存技術(shù)細(xì)胞的低溫保存細(xì)胞的低溫保存o細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞遺傳性狀的改變和延緩衰老。少細(xì)胞遺傳性狀的改變和延緩衰老。o目前，動(dòng)物細(xì)胞一般保存于液氮中目前，動(dòng)物細(xì)胞一般保存于液氮中 （-196）。）。 一般在原代或傳代一般在原代或傳代210次內(nèi)即次內(nèi)即大量?jī)龃?，作為原種大量?jī)龃?，作為原種（stock cells），取一支細(xì)胞進(jìn)行傳代繁殖，用畢再凍取一支細(xì)胞進(jìn)行傳代繁殖，用畢再凍存，這樣可保證

2、長(zhǎng)期使用和延緩衰存，這樣可保證長(zhǎng)期使用和延緩衰老老 。 根據(jù)細(xì)胞冷凍液在在凍結(jié)后是否形成冰晶，低溫根據(jù)細(xì)胞冷凍液在在凍結(jié)后是否形成冰晶，低溫冷凍保存細(xì)胞可分為：冷凍保存細(xì)胞可分為： 1非玻璃化冷凍非玻璃化冷凍 細(xì)胞在冷凍過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的水形成冰晶。細(xì)胞在冷凍過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的水形成冰晶。 2玻璃化冷凍玻璃化冷凍 細(xì)胞在冷凍過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的水不形成冰細(xì)胞在冷凍過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的水不形成冰 晶，而是形成玻璃態(tài)。晶，而是形成玻璃態(tài)。非玻璃化冷凍非玻璃化冷凍原則：緩慢冷凍原則：緩慢冷凍原因原因：當(dāng)溫度降低到冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分就會(huì)：當(dāng)溫度降低到冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水

3、分就會(huì) 形成冰晶。細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)形成冰晶。細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì) 胞器的損傷。這種損傷稱為細(xì)胞內(nèi)胞器的損傷。這種損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷冰晶損傷。 細(xì)胞外的水形成冰晶后，使得未結(jié)冰的溶液中的細(xì)胞外的水形成冰晶后，使得未結(jié)冰的溶液中的 電解質(zhì)的濃度升高，細(xì)胞在這種高濃度的溶質(zhì)中電解質(zhì)的濃度升高，細(xì)胞在這種高濃度的溶質(zhì)中 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使細(xì)胞膜上的脂質(zhì)受到損害，細(xì)胞時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使細(xì)胞膜上的脂質(zhì)受到損害，細(xì)胞 膜破裂，這種損害稱之為膜破裂，這種損害稱之為溶質(zhì)損傷溶質(zhì)損傷。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶，從而減少細(xì)胞內(nèi)冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷；相反，結(jié)晶很大，

4、大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。 在細(xì)胞凍存時(shí)加入冷凍保護(hù)劑，可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷。 原理：1.常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，降低細(xì)胞的冰點(diǎn) 2.提高胞膜對(duì)水的通透性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)水滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷；解凍時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞外水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，緩解滲透性腫脹。 3.稀釋細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中的電解質(zhì)，減少溶質(zhì)損傷。解決辦法：解決辦法：冷凍保護(hù)劑的應(yīng)用保護(hù)劑的應(yīng)用在培養(yǎng)液中添加的保護(hù)劑：在培養(yǎng)液中添加的保護(hù)劑： 二甲亞砜二甲亞砜（Dimeethylsulfoide,DMSODimeethylsulfoide,DMSO），）

5、， 甘油甘油, ,可使細(xì)胞免受低溫冰晶形成、及滲透壓可使細(xì)胞免受低溫冰晶形成、及滲透壓改變而導(dǎo)致的物理?yè)p傷。改變而導(dǎo)致的物理?yè)p傷。 預(yù)先配制凍存預(yù)先配制凍存保護(hù)保護(hù)液：液： 含含20%血清培養(yǎng)基，血清培養(yǎng)基，10%DMSO，DMSO液用培養(yǎng)液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞；液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞；凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水

6、，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。凍存培養(yǎng)細(xì)胞凍存培養(yǎng)細(xì)胞 (1)(1)預(yù)保留細(xì)胞經(jīng)消化分散后，用將其預(yù)冷卻，預(yù)保留細(xì)胞經(jīng)消化分散后，用將其預(yù)冷卻，4 4度度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嫒?duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉阂? ,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1- 5 10

7、6細(xì)胞細(xì)胞/ /ml) )； 冷凍保護(hù)劑降溫時(shí)減少細(xì)胞內(nèi)冰晶分子的形成，以冷凍保護(hù)劑降溫時(shí)減少細(xì)胞內(nèi)冰晶分子的形成，以免對(duì)細(xì)胞造成傷害。免對(duì)細(xì)胞造成傷害。 (2)(2)加入加入1ml細(xì)胞懸液于凍存管中，在火細(xì)胞懸液于凍存管中，在火焰下將安瓿封口。密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞焰下將安瓿封口。密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。名稱和冷凍日期。 可用帶有可用帶有18G針頭注射器進(jìn)行分裝，針頭注射器進(jìn)行分裝，如劑量過(guò)大，如劑量過(guò)大，保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞滲透作用不勻，冷凍效果不好。保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞滲透作用不勻，冷凍效果不好。 (3)(3)加保護(hù)劑的細(xì)胞懸液經(jīng)緩慢冷凍，加保護(hù)劑的細(xì)胞懸液經(jīng)緩慢冷凍，結(jié)冰產(chǎn)生在細(xì)胞外結(jié)冰產(chǎn)生在細(xì)

8、胞外( (對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損傷對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損傷) )。如果要長(zhǎng)期保存，可以使用液氮罐，如果要長(zhǎng)期保存，可以使用液氮罐， (4)(4)凍結(jié)好的安瓿放入低溫冰柜或液氮罐中。凍結(jié)好的安瓿放入低溫冰柜或液氮罐中。溫度達(dá)溫度達(dá)-150-190 -150-190 ，細(xì)胞幾乎處在停止，細(xì)胞幾乎處在停止?fàn)顟B(tài)。狀態(tài)。 冷凍時(shí)帶手套操作，以免凍傷。冷凍時(shí)帶手套操作，以免凍傷。慢凍程序慢凍程序 標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在-25以上時(shí)， 12/min 當(dāng)溫度達(dá)-25以下時(shí)， 510/min 當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中緩慢冷凍的簡(jiǎn)化程序緩慢冷凍的簡(jiǎn)化程序配置冷凍保護(hù)液配置冷凍保護(hù)液血清（一般血清（一般20%） 將冷凍液加入

9、離心管，使將冷凍液加入離心管，使 細(xì)胞濃度為細(xì)胞濃度為 26106cell/ml將冷凍液分裝到冷凍管中將冷凍液分裝到冷凍管中44冰箱放置冰箱放置30-60min-30-60min-20 -20 冰箱放置冰箱放置2小時(shí)小時(shí)（冷凍管放入泡沫盒或用棉花紗布包裹）（冷凍管放入泡沫盒或用棉花紗布包裹）-70-70冰箱放置冰箱放置1-21-2天天投入液氮罐投入液氮罐取旺盛生長(zhǎng)的細(xì)胞取旺盛生長(zhǎng)的細(xì)胞,消化后消化后用離心管離心回收細(xì)胞用離心管離心回收細(xì)胞在沒(méi)有程序控制凍存器設(shè)備的條件下在沒(méi)有程序控制凍存器設(shè)備的條件下, 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每

10、分鐘溫度下降12的速 度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。-196-196液氮罐液氮罐普通冰箱普通冰箱低溫冰箱低溫冰箱解凍程序解凍程序原則：原則：快速解凍快速解凍原因原因：解凍緩慢時(shí)，原有冰晶溶化后，又會(huì)以新的晶核為解凍緩慢時(shí)，原有冰晶溶化后，又會(huì)以新的晶核為 中中 心形成更大的冰晶，稱為水的重結(jié)晶現(xiàn)象。但采心形成更大的冰晶，稱為水的重結(jié)晶現(xiàn)象。但采 用快速解凍可避免水分的重結(jié)晶減少冰晶損傷用快速解凍可避免水分的重結(jié)晶減少冰晶損傷。解凍程序解凍程序：從液氮中取出冷凍管，快速放入從液氮中取出冷凍管，快速放入37- 40水浴水浴 中，輕輕震搖，使凍存細(xì)胞盡快解凍（中，輕輕震

11、搖，使凍存細(xì)胞盡快解凍（40-60s). 玻璃化冷凍玻璃化冷凍原則：原則：快速冷凍快速冷凍原因：原因：從理論上講，只要獲得足夠快的降溫速度，任何從理論上講，只要獲得足夠快的降溫速度，任何 液體都可以進(jìn)入玻璃化狀態(tài)。例如：要是純水進(jìn)液體都可以進(jìn)入玻璃化狀態(tài)。例如：要是純水進(jìn) 入玻璃化狀態(tài)，降溫速度需高達(dá)入玻璃化狀態(tài)，降溫速度需高達(dá) 1010/s，以現(xiàn)，以現(xiàn) 在的條件沒(méi)辦法達(dá)到。在的條件沒(méi)辦法達(dá)到。解決辦法：解決辦法：通過(guò)添加高濃度的冷凍保護(hù)劑，通過(guò)添加高濃度的冷凍保護(hù)劑，可以顯著降低形成玻璃化所要求的降溫速可以顯著降低形成玻璃化所要求的降溫速度。度。一般冷凍保護(hù)劑的濃度為一般冷凍保護(hù)劑的濃度為4

12、0%-60%。 冷凍保護(hù)劑：冷凍保護(hù)劑：DMSO、乙酰胺、丙二醇、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇等。聚乙二醇等。玻璃化冷凍的程序玻璃化冷凍的程序配置冷凍液配置冷凍液在平衡鹽溶液（在平衡鹽溶液（Hanks）中加）中加20.5%DMSO(w/v)15.5%乙酰胺乙酰胺(w/v ) 、10%丙二醇和丙二醇和10%聚乙二醇。（以單核細(xì)胞為例）聚乙二醇。（以單核細(xì)胞為例）取旺盛生長(zhǎng)的細(xì)胞，消化后用離取旺盛生長(zhǎng)的細(xì)胞，消化后用離心管離心回收細(xì)胞，并將離心管心管離心回收細(xì)胞，并將離心管置于冰浴中置于冰浴中將預(yù)冷的冷凍液緩慢地滴加到離心管中，使細(xì)將預(yù)冷的冷凍液緩慢地滴加到離心管中，使細(xì)胞濃度為胞濃度為1-1.51-

13、1.510106 6cell/mlcell/ml。（滴加的速度先慢后快，具體過(guò)程如下:前3分鐘以0.3ml/min滴加；后5分鐘以0.6ml/min滴加；余下的以0.75ml/min滴加）將含有細(xì)胞的冷凍液將含有細(xì)胞的冷凍液 分裝到冷凍管中分裝到冷凍管中將冷凍管投入液氮將冷凍管投入液氮-196-196液氮罐液氮罐解凍程序解凍程序從液氮中取出冷凍管從液氮中取出冷凍管放入冰浴中放入冰浴中5min5min，使其融凍，使其融凍轉(zhuǎn)移到離心管，并放入冰浴中轉(zhuǎn)移到離心管，并放入冰浴中將已在冰浴中預(yù)冷的含將已在冰浴中預(yù)冷的含20%20%血清的血清的HanksHanks液對(duì)細(xì)胞凍存懸液稀液對(duì)細(xì)胞凍存懸液稀釋。釋。（稀釋過(guò)程要緩慢，具體過(guò)程如下：前（稀釋過(guò)程要緩慢，具體過(guò)程如下：前1010分鐘分鐘0.2ml/min0.2ml/min速速度滴加；接下來(lái)度滴加；接下來(lái)1010分鐘以分鐘以0.5ml0.5ml滴加；接下來(lái)的滴加；接下來(lái)的1515分鐘以分鐘以0.75ml/min0.75ml/min滴加；最后滴加；最后30min30min以以1ml/min1ml/min滴加）滴加）離心回收細(xì)胞，棄上清，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞離心回收細(xì)胞，棄上清，加入培養(yǎng)