臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢

1、臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR試劑盒的組成試劑盒的組成n核酸提取試劑n核酸擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄-核酸擴(kuò)增試劑n產(chǎn)物檢測(cè)試劑（有些使用全自動(dòng)分析儀的PCR方法因其核酸擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)完成，故無(wú)專門的產(chǎn)物檢測(cè)試劑）臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢影響影響PCRPCR試劑盒質(zhì)量的因素試劑盒質(zhì)量的因素n內(nèi)在因素: 原材料、核酸提取方法、方法學(xué)設(shè)計(jì)臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢影響影響PCRPCR試劑盒質(zhì)量的因素：試劑盒質(zhì)量的因素： 擴(kuò)增所需的原材料擴(kuò)增所需的原材料n寡核苷酸引物和探針n緩沖液和dNTPn聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR反

2、應(yīng)混合物反應(yīng)混合物 Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA 多 聚 酶rTth DNA 多 聚 酶AmpErase 生 物 素 標(biāo) 記 的 引 物 和和 或或 和和臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢寡核苷酸引物和探針寡核苷酸引物和探針n其對(duì)試劑盒質(zhì)量的影響首先是純度。其對(duì)試劑盒質(zhì)量的影響首先是純度。純度的判斷可根據(jù)260/280吸光度比值來(lái)判斷，如2.0，則需重新純化。另一種方法是將其在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，如出現(xiàn)一條以上的帶或遷移位置錯(cuò)誤，則需重新純化。n是否有污染。是否有污染。n結(jié)合特異性（濃度）結(jié)合特異性（濃度）臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢dNTPdNTP和緩沖液和緩沖液n

3、dNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的濃度n緩沖液：在儲(chǔ)存和擴(kuò)增循環(huán)中穩(wěn)定、作為聚合酶活性所必須的Mg（或用于rTth的Mn）的濃度以及pH等臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNADNA聚合酶聚合酶n酶的濃度n酶的活性臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢核酸擴(kuò)增方法核酸擴(kuò)增方法nPCRnRTPCRn轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增（TMA）n連接酶鏈反應(yīng)（LCR）n鏈替代擴(kuò)增（SDA）等臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢影響影響PCRPCR試劑盒質(zhì)量的因素：試劑盒質(zhì)量的因素： 核酸提取核酸提取n核酸提取的有效性n核酸提取的簡(jiǎn)便性 臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)

4、檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢影響影響PCRPCR試劑盒質(zhì)量的因素：試劑盒質(zhì)量的因素： 產(chǎn)物檢測(cè)產(chǎn)物檢測(cè)n雜交固相n特異探針及其標(biāo)記物臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢影響影響PCRPCR試劑盒質(zhì)量的因素試劑盒質(zhì)量的因素n內(nèi)在因素: 原材料、核酸提取方法、方法學(xué)設(shè)計(jì)n外在因素：試劑盒的運(yùn)輸和貯存外在因素：試劑盒的運(yùn)輸和貯存臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢試劑盒的運(yùn)輸和貯存試劑盒的運(yùn)輸和貯存nPCR試劑盒的有效期一般為6個(gè)月，這是指在適當(dāng)?shù)馁A存溫度下。核酸擴(kuò)增部分的試劑一般要貯存于-20下；產(chǎn)物檢測(cè)部分試劑則貯存于28。n試劑盒從廠家

5、到用戶手中，均要經(jīng)歷運(yùn)輸及運(yùn)輸中的貯存，任一環(huán)節(jié)的不當(dāng)，均會(huì)影響試劑盒的臨床使用質(zhì)量。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR試劑盒的分類試劑盒的分類n定性測(cè)定：PCR-ELISA、PCR-膜上雜交（雜交梳）、熒光PCR（分子信標(biāo)和Taq Man等）n定量測(cè)定： PCR-ELISA 、Taq Man和Amplisensor熒光定量、 Amplicor PCR-ELISA定量等。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR試劑盒的選用原則試劑盒的選用原則n參考試劑生產(chǎn)廠家的信息廣告n參考同行對(duì)有關(guān)試劑盒的使用效果n參考有關(guān)機(jī)構(gòu)的綜合評(píng)價(jià)n根據(jù)使用目的n根據(jù)所在實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)特點(diǎn)n根據(jù)所在醫(yī)院患者的承受能力

6、臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR試劑盒的質(zhì)檢試劑盒的質(zhì)檢n外包裝：廠家名稱、檢測(cè)目的、批準(zhǔn)文號(hào)、批號(hào)和有效期等。n內(nèi)包裝：試劑瓶是否漏液、真空包裝是否破損以、試劑是否齊全以及是否有使用說(shuō)明書等。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR試劑盒的質(zhì)檢試劑盒的質(zhì)檢( (定性測(cè)定定性測(cè)定) )n性能質(zhì)檢性能質(zhì)檢n采用血清（樣本）盤（采用血清（樣本）盤（PanelPanel）質(zhì)檢）質(zhì)檢： PCR試劑血清（樣本）盤由一定數(shù)量的原血清陰、陽(yáng)性樣本、23份純化核酸（DNA或RNA或cDNA）樣本以及35份系列稀釋陽(yáng)性樣本所組成。樣本總數(shù)可定在20份左右。 n原血清樣本用于判斷試劑盒對(duì)特定病原體核酸原血清樣

7、本用于判斷試劑盒對(duì)特定病原體核酸檢出的特異性、靈敏度和符合率；純化核酸樣檢出的特異性、靈敏度和符合率；純化核酸樣本用于判斷本用于判斷DNADNA擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄及DNADNA擴(kuò)增的有效擴(kuò)增的有效性；系列稀釋陽(yáng)性樣本用于判斷試劑的測(cè)定下性；系列稀釋陽(yáng)性樣本用于判斷試劑的測(cè)定下限。限。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢試劑特異性、靈敏度和符合率試劑特異性、靈敏度和符合率計(jì)計(jì) 算算 公公 式式臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢試劑特異性、靈敏度和符合率試劑特異性、靈敏度和符合率計(jì)計(jì) 算算 公公 式式n靈敏度（） (a / a+c)100%n特異性（） (d/b+d) 100%n符合率（） (a+d/a+b

8、+c+d) 100%臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢PCRPCR試劑盒的質(zhì)檢試劑盒的質(zhì)檢( (定量測(cè)定定量測(cè)定) )n樣本：已知濃度的高、中、低三種濃度質(zhì)控物。n質(zhì)檢內(nèi)容：測(cè)定的重復(fù)性 測(cè)定范圍 抗干擾能力臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢技術(shù)驗(yàn)收依據(jù)：n臨床檢驗(yàn)擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法 衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號(hào)n臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范 衛(wèi)檢字2002第8號(hào)臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢技術(shù)驗(yàn)收內(nèi)容技術(shù)驗(yàn)收內(nèi)容n實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和設(shè)備n設(shè)施和環(huán)境n人員n設(shè)備管理n檢測(cè)方法n標(biāo)本管理n記錄n報(bào)告n質(zhì)量控制n抱怨 等十章共三十八條臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和設(shè)備實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和設(shè)備n本章共七條。 n實(shí)驗(yàn)室分區(qū)

9、：規(guī)范化分區(qū)、明確的識(shí)別標(biāo)記n防污染：空氣流向、中央空調(diào)、各區(qū)間的封閉性n各區(qū)儀器設(shè)備物品配備：充分性、科學(xué)性、專用性（標(biāo)識(shí)） “生物安全柜生物安全柜” “可移動(dòng)紫外燈可移動(dòng)紫外燈” “加樣器加樣器”臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢設(shè)施和環(huán)境設(shè)施和環(huán)境n本章包括五條；n實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、工作區(qū)域、能源、照明等；n環(huán)境和實(shí)驗(yàn)條件控制設(shè)施：溫濕度計(jì)溫濕度計(jì)、不間斷不間斷或穩(wěn)壓電源等或穩(wěn)壓電源等；n實(shí)驗(yàn)室進(jìn)出的限制和控制：人員進(jìn)入控制標(biāo)識(shí)、生物傳染危險(xiǎn)性標(biāo)識(shí)n實(shí)驗(yàn)室“內(nèi)務(wù)管理”（如人員流動(dòng)、清潔等）制度和相應(yīng)設(shè)施；n廢棄血清處理、生物防護(hù)等措施和相應(yīng)設(shè)施臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢設(shè)施和環(huán)境需注意的問(wèn)題設(shè)施和環(huán)境

10、需注意的問(wèn)題n清潔程序或制度 清潔用具的專用、清潔工作的單一流向、清潔用具的專用、清潔工作的單一流向、清潔方法的具體性清潔方法的具體性n生物防護(hù)及廢棄血清處理 對(duì)工作人員工作人員的保護(hù)和對(duì)環(huán)境環(huán)境的保護(hù) 銳器銳器使用規(guī)則 生物傳染危險(xiǎn)性廢棄物出實(shí)驗(yàn)室前出實(shí)驗(yàn)室前預(yù)處理臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢人人 員員n本章包括三條。n人員數(shù)量足夠；有培訓(xùn)上崗證n培訓(xùn)計(jì)劃：室內(nèi)的定期培訓(xùn)（記錄）n人員技術(shù)（資格、培訓(xùn)、技能）檔案。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢設(shè)備管理（設(shè)備管理（1 1）n本章包括三條。n主要儀器設(shè)備應(yīng)得到正確維護(hù)，應(yīng)有設(shè)備維護(hù)程序文件；以及維護(hù)的記錄n加樣器、溫度計(jì)、擴(kuò)增儀和酶標(biāo)儀等設(shè)備應(yīng)有校準(zhǔn)

11、程序文件、有明顯標(biāo)識(shí)表明其校準(zhǔn)狀態(tài)（此次校準(zhǔn)時(shí)間及下次應(yīng)校準(zhǔn)時(shí)間）；n實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存每一臺(tái)儀器設(shè)備的檔案材料，對(duì)檔案材料的具體內(nèi)容作了詳細(xì)規(guī)定。 臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢設(shè)備和質(zhì)控物（設(shè)備和質(zhì)控物（2 2）n每一臺(tái)設(shè)備的檔案內(nèi)容包括： （a）設(shè)備名稱；（b）制造商名稱、型號(hào)、序號(hào)等；（c）接收日期和啟用日期；（d）目前放置地點(diǎn)；（e）接收時(shí)的狀態(tài)；（f）儀器使用說(shuō)明書有復(fù)印件；（g）校準(zhǔn)和/或檢定的日期和結(jié)果及下次校準(zhǔn)和/或檢定的日期；（h）迄今所進(jìn)行的維護(hù)和今后維護(hù)計(jì)劃的細(xì)節(jié)；（i）損壞、故障、改裝或修理的歷史。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢檢檢 測(cè)測(cè) 方方 法法n本章包括三條。n標(biāo)準(zhǔn)操作程序（

12、SOP）：儀器設(shè)備操作和校準(zhǔn)程序；標(biāo)本收集處理程序；擴(kuò)增檢測(cè)工作程序；儀器試劑的選購(gòu)和質(zhì)檢程序；消耗性材料的購(gòu)買、驗(yàn)收、質(zhì)檢和貯存程序。nSOP應(yīng)現(xiàn)行有效及便于使用。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢標(biāo) 本 管 理n本章包括五條。n建立唯一編號(hào)識(shí)別系統(tǒng)，避免標(biāo)本混淆；n標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存程序；n標(biāo)本接收時(shí)的狀態(tài)記錄；n標(biāo)本的適用性和充分性；n標(biāo)本貯存的標(biāo)準(zhǔn)操作程序及貯存溫度控制措施;n標(biāo)本接收及安全處置程序；n維護(hù)實(shí)驗(yàn)室誠(chéng)實(shí)性的必要措施。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢記記 錄錄n本章包括三條。n有記錄管理制度：適合自身實(shí)際情況，符合現(xiàn)行規(guī)章制度；（由誰(shuí)管、在何處管、保存多長(zhǎng)時(shí)間）n原始記錄、計(jì)算和導(dǎo)出數(shù)據(jù)應(yīng)歸檔并保存；n記錄應(yīng)有有關(guān)人員的簽字；n所有記錄和報(bào)告都要妥善保管并保密。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢報(bào)報(bào) 告告n檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告應(yīng)準(zhǔn)確、清晰和客觀；n定性測(cè)定報(bào)告“陰性”或“陽(yáng)性”；定量測(cè)定則以拷貝數(shù)/ml或IU/ ml報(bào)告；避免二者之間的混淆；n每份報(bào)告應(yīng)包括以下信息：標(biāo)題、唯一標(biāo)識(shí)、檢測(cè)標(biāo)本說(shuō)明、標(biāo)本特性和狀態(tài)、標(biāo)本接收日期和檢測(cè)日期、檢測(cè)方法、檢測(cè)和校核人員簽字及發(fā)出日期、參考結(jié)果或范圍；n如對(duì)報(bào)告有效性有疑問(wèn)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)立即通知臨床相關(guān)科室予以改正的程序；n有報(bào)告的發(fā)放程序：用 、 、電子郵件報(bào)告結(jié)果時(shí)的保密原則。臨床CR試劑盒的選用和質(zhì)檢質(zhì)質(zhì) 量量 控控 制制n實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有室內(nèi)質(zhì)量