植物病害標本采集與制作指導書

1、標本采集與制作綜合實習（植物病害）指導教師：丁曉帆 適用專業(yè)：植保植物病害標本是對其癥狀的最直觀的記載和描述。它在教學中具有直觀、不受季節(jié)和區(qū)域限制的特點。因此，植物病害標本的采集、制作和保存是植物病理學科實驗（習）教學中必不可少的基礎知識和技能。在植物病害標本的采集和制作過程中，應對癥狀的變化情況給以特殊的注意。例如，癥狀可能表現(xiàn)為典型癥狀，也可能表現(xiàn)為非典型癥狀，在采集時，均應加以注意。一種病害，在同一種植物上，可以同時表現(xiàn)出多種不同類型的癥狀；在植物生長發(fā)育的不同時期，也可以先后表現(xiàn)出多種不同類型的癥狀，如橡膠白粉病。標本采集后，除去需要及時分離和鑒定的標本外，其余的一般都要經(jīng)過制作之后

2、保存起來，以備需要時進行分離和鑒定；或者是在教學和研究時，供觀察和識別，要求是能盡量保持原來的性狀。一、目的要求學會采集植物病害標本的基本方法。通過對常見的葉片和果穗等干標本以及對柔嫩果實的浸漬標本的制作，同時訓練真菌玻片標本的制作，學習并掌握標本干燥制作、浸漬制作以及玻片標本制作等基本方法。二、基本原理 室外采集標本是獲取植物病害標本的重要途徑，也是熟悉植物病害的癥狀，了解植物病害發(fā)生情況的最好方式。標本的制作是為了日后能較為方便地觀察植物病害的癥狀，無論用干燥制作法保存標本，還是用浸漬制作法保存標本，都是為了盡量減緩所保存標本變質(zhì)的速度或不使其腐爛霉變。同時也是為了盡量使標本保持其原色，以

3、延長標本的使用時間和提高標本的保存質(zhì)量。真菌玻片標本的制作是為了直觀地觀察病原物、輔助診斷、鑒定病害種類，并通過永久玻片標本的制作為后續(xù)教學工作提供基本素材。三、采集和制作標本用具1采集標本的用具 采集夾、采集袋、標本夾、標本紙、標本箱(筒)、剪刀、修枝剪、高枝剪、手鋸、手鏟、紙袋、標簽、手持放大鏡及采集記錄本、海拔儀、刀片、載玻片、蓋玻片、小木板、挑針、鑷子、滴瓶、各種試劑等。(1)采集夾。在野外臨時收存新采標本的輕便夾子。一般由兩個對稱的用一些木條按適當?shù)拈g距平行排列的柵狀板(亦有用膠合板或硬紙板組成的)，其上附有背帶，在接近四個角落的地方，設有長短可以調(diào)整的活動固定帶或彈簧，以適應采集過

4、程中標本逐漸增多的需要。(2)采集箱。用于臨時收存新采集的果實等柔軟多汁的標本。是由鐵皮制成的扁圓箱，內(nèi)側(cè)較平，外側(cè)較鼓，箱門設在外側(cè)，箱上設有背帶。(3)標本夾。是用來翻曬、壓制標本的木夾。由兩個對稱的一些平行排列的柵狀板組成。每塊柵狀板在接近上下端處釘一根厚實的方木條，木條端部向外突出約5cm長，以便于用繩捆綁標本夾。標本夾上：應附有約6m長的一條繩子。 (4)標本紙。主要用來吸收標本的水分，使標本逐漸干燥。般用草紙或麻紙作標本紙，它們的吸水性較好。舊報紙也可代替，但因其上有油墨吸水性較差。(5)修枝剪。主要用于剪取較硬或韌性較強的枝條，高處的枝條要使用高枝剪，難于折斷的枝干則要借助于手鋸

5、。手鏟用來挖掘地下患病植物器官(如根、塊根、塊莖等)。2制作植物標本用具及試劑 剪刀、標簽、標本瓶、玻璃瓶、玻璃板、塑料繩、標本盒、水浴鍋(或簡單的加熱裝置)、水、硫酸酮、亞硫酸、甲醛溶液、明膠、石蠟等。四、實驗操作(一)室外采集1病葉 用剪刀剪取病植物上的發(fā)病葉片。如小麥（玉米、美人蕉等）銹病的病葉、水稻稻瘟病的病葉、玉米葉斑病（大、小斑?。┑牟∪~、大豆（瓜類）霜霉病的病葉、馬鈴薯晚疫病的病葉、丁香（九里香）白粉病的病葉及香蕉黑星病的病葉等，裝入采集夾中。盡量剪取整個病葉，同時，對于每一片葉上的病斑，在顏色、大小以及形狀方面都應是較為一致的。2病穗 用剪刀剪取水稻稻曲病的病穗、玉米絲黑穗病的

6、病穗及玉米瘤黑粉病的病穗等，裝入采集筒中。對于黑粉類的病穗，每種病穗要及時放入小的采集袋中，同時注意隔離，以防黑粉散落和不同病穗間相互混雜。3病果 用剪刀剪取茄子褐紋病的病果、番茄（柑橘）潰瘍病的病果、辣椒炭疽病的病果以及香蕉黑星?。ㄌ烤也。┑牟」?，裝入采集筒中。對于此類標本，特別是對于像番茄一類多汁的病果，要特別加以注意，應先以標本紙分別包裹后，置于采集筒(箱)中，以防相互擠壓而變形。4病根 用鐵鏟挖取植物根結線蟲病的病根以及白菜根腫病的病根等，裝入采集筒中。在挖取此類病害的標本時，要注意挖取點的范圍要比較大一些，以保證取得整個根部。同時，對于像根結線蟲病害一類的病根，在除去根須上的泥土時

7、，操作要謹慎，保證其根須上的小根結和卵塊不散落。一般情況下，各種病害的標本最好采集10份以上。對于較薄的較易失水的葉片，如小麥和水稻的葉片，在采集時應隨時攜帶吸水紙或廢舊的書，隨采隨壓，以免葉片迅速打卷而不易展開。提示：在采集病斑類的葉片標本時，一個葉片上應只有一種類型的病斑。尤其是在各種病害混合發(fā)生時采集標本，更需進行仔細的選擇；對于真菌病害，標本應帶有子實體，無子實體在回到室內(nèi)后，鑒定將非常困難。(二)采集記錄采集時，要隨時作標記。臨時標簽上一般應記錄如下項目：寄主名稱：俗名和學名都有時，應同時記下。采集時間：一般應記錄年、月、日。采集地點：一般記錄到省、市(縣)即可，需要時也可記錄到鎮(zhèn)(

8、鄉(xiāng))等。采集人：姓名。海拔高度：按海拔儀指示記錄。（可不記）生態(tài)環(huán)境：按照山坡地、平坦地、沼澤地；砂質(zhì)土、肥沃土等記錄。采集序號：一般按照采集時間的先后順序記錄。提示：寄主名稱如有不清楚的，能及時向當?shù)厝藛柮鞲?；如不能，應記下采集地的位置以及寄主的一些主要性狀，以備鑒定時參考。必要時還應將寄主的花、果實以及其他部位標本一起采得，以便憑借寄主的標本對該寄主進行分類鑒定。(三)標本的攜帶田間采集后，莖或葉片類的標本裝入采集袋中，每一種病葉放入一個小袋內(nèi)之后，最好再放入一個大一點的采集袋內(nèi)；對于根或果實類的標本，各種標本在裝入采集筒之前應分別用小采集袋裝好密封或用紙包裹好，然后，再裝入采集筒中。對

9、于黑粉類的標本(如玉米絲黑穗的病穗)，或腐爛類的標本(如茄子褐紋病病果)等，要特別注意，標本間不要相互接觸沾污，否則，對于病原的鑒定和病害的診斷會有影響。(四)標本的整理在完成田間采集的過程之后，首先要在室內(nèi)進行標本的取舍和初步的整理。對于同一種病害的標本，應盡量保留帶有典型癥狀的標本。同時，對于真菌性病害，在發(fā)病部位應帶有子實體，葉片或果實要保持完整。在整理時，應使其形狀盡量恢復自然狀態(tài)。對于采集到的比較稀少的標本，如癥狀不典型，或暫時觀察不到子實體，也不要舍棄。應該同樣制作成標本，以備日后采取措施進行鑒定。如果外出采集，每天晚上都要將當天采集的標本進行整理、壓制，第二天及時換紙或晾曬，防止

10、霉變。(五)干燥標本的制作1含水量小的標本的壓制 對于像水稻和小麥等植物，其葉片比較薄，它們的葉片病害標本，需要經(jīng)過整理后，立即進行壓制。對于此類標本，在壓制時，標本間的標本紙最好要多放幾層，一般每層至少用35張標本紙，以利于標本中水分的快速散失。2含水量大的標本的壓制 對于像甘藍、大白菜、馬鈴薯等比較厚、不易失水的葉片，最好經(jīng)過一段時間(12d)的自然散失水分，然后，再進行壓制。自然散失水分的時間不宜過長。在具體操作時，最好是在葉片將要卷曲但還未卷曲時進行，這與具體植物和環(huán)境條件有關。 3附臨時標簽 在壓制時，每份標本都要附上臨時標簽，即將臨時標簽隨著標本壓在吸水紙之間。臨時標簽上的項目不必

11、記載過多，一般只需記錄寄主名稱和順序號即可，以防標本間相互混雜。寫臨時標簽時，應使用鉛筆記錄，以防受潮后字跡模糊，影響識別。4標本整理 在第1次換紙前，要對標本進行形狀的整理，盡量使其舒展自然。在整理時，要十分小心。特別對于比較柔嫩的植物標本，更應多加注意，以免破損。5換紙 一般情況下，前一周的時間里要每天換干燥的吸水紙1次。以后的時間，可隔天換紙，視情況而定，直至標本完全干燥為止(在正常的晴好的天氣條件下，一般經(jīng)過10d左右的時間即完全干燥)。在換紙時，注意不要遺失臨時標簽；要特別注意不要混用已經(jīng)污染了的紙張；對于完全干燥的標本，要特別小心移動，以防破碎。6果穗及較粗大莖的標本的干燥 對于這

12、類標本應置于朝陽(但應避免強光直射)通風處，置于吸水紙上，進行自然干燥。同時，也要定期進行翻動，使其整體較為均勻地干燥。對于此類標本的干燥，開始時，就要選擇在比較寬敞的空間內(nèi)進行，以免其整個形狀被擠壓而發(fā)生變形。7裝袋保存 用重磅道林紙(也可用牛皮紙，對于不用作交流的標本，也可報紙代替)，折成紙袋如下圖，紙袋的大小可據(jù)標本的大小而定，其折疊方式也可據(jù)標本的不同形狀而做適當?shù)母倪M。在裝袋時，要隨時貼上正式標簽。(六)浸漬標本的制作此法制作的標本易保持標本原來的形態(tài)和色澤，但保存的時間有限，且需占用比較大的空間。一般用于制作教學和示范標本。1常用的浸漬液(1)防腐漂白浸漬液。此種浸漬液是由亞硫酸飽

13、和溶液、酒精和水按照一定比例配制而成。亞硫酸飽和溶液，即指二氧化硫的飽和水溶液。(2)保存綠色的浸漬液。常用的有如下幾種：醋酸銅浸漬液。反復用多次后保色能力會逐漸減弱，需定期補加適量的醋酸銅。硫酸銅亞硫酸浸漬液。用于保存綠色植物組織的效果很好，但應注意密封容器，必要時每年換1次亞硫酸浸漬液。此種方法也是實驗室較為常用的液浸標本的保存方法。瓦查(Vacha)浸漬液。由亞硫酸、硫酸銅、酒精、乙酰水楊酸、福爾馬林、丁香油和水等成分按比例配制而成。適于保存葉片和果實的綠色，也可保存梨和蘋果等的黃色。(3)保存黃色和橘紅色標本的浸漬液。配制方法是將亞硫酸(含二氧化硫56)配成410的水溶液(二氧化硫02

14、05)?？杀４嫒缧?、梨、柿、黃蘋果、柑橘和紅辣椒等標本。(4)保存紅色的浸漬液。瓦查(Vacha)保存紅色的浸漬液。此種浸漬液分兩部分：浸漬液1的主要成分為硝酸亞鈷、福爾馬林、氯化錫等；浸漬液2的主要成分為福爾馬林、亞硫酸、酒精等。將標本洗凈后，在浸漬液1中浸兩周，然后在浸漬液2中保存?？捎糜诒４娌葺?、辣椒、馬鈴薯以及其他紅色的植物組織，是一種效果比較好的浸漬液。2浸漬標本的保存 浸漬標本一般保存在標本瓶、玻璃瓶或試管中。浸漬標本最好置于暗處，以減緩藥液的氧化，或防止氣溫過高時瓶口碎裂。瓶口一般需要密封，臨時性封口時，可用蜂蠟、松香和凡士林配成的混劑封口；永久性封口時，可用酪膠和消石灰配成的混

15、劑封口；也可用明膠、重鉻酸鉀和熟石膏調(diào)制而成的混劑進行永久性的封口。(1)配制硫酸銅溶液。根據(jù)需要，一般配制1000m1 5的硫酸銅水溶液，在適當?shù)牟Ａ萜髦小Ｅ渲迫芤呵?，要考慮到所浸標本的大小，保證所浸標本全部位于液面下。(2)預浸病果。從室外采來新鮮的辣椒炭疽病的病果，在盛有5的硫酸銅溶液的玻璃瓶中浸24h。浸病果時，需臨時將病果用塑料繩縛在玻璃板上，一起放入溶液中。否則，病果易浮在液面上，特別是對于像辣椒這樣的空心的果實，更易漂浮在液面上。(3)漂洗病果。從5的硫酸銅溶液中取出病果，用清水漂洗6h。可固定在水籠頭下，打開水閥用流水進行沖洗。在沖洗時，水流不宜太急，否則，易破損標本，或?qū)⒆?/p>

16、實體沖刷掉。(4)配制亞硫酸溶液。在標本瓶中將含5-6二氧化硫的亞硫酸溶液15ml加水1 000ml(也可用如下方法配制，即將濃硫酸20m1，稀釋在1000ml水中然后加亞硫酸鈉16g)。提示：配制溶液時，要記住，將濃硫酸沿瓶壁緩緩倒入水中，切不可將水倒入濃硫酸中，以防發(fā)生事故。(5)固定病果。將沖洗后的病果用塑料繩將其縛在玻璃板上，一起浸入配制好的亞硫酸溶液中。固定時，要小心操作，盡量不要損壞標本，保持其完整。(6)封口。先配制封口劑，具體方法是：取明膠200g，石蠟50g(此兩試劑的量可據(jù)需要量而定，一般按照明膠石蠟=41取量)。將明膠置于玻璃瓶中，用水浸6h，濾去水分。之后，在水浴鍋中加

17、熱熔化；再加入石蠟，熔化后即可成為膠狀物，趁熱進行涂抹封口。提示：封口劑配制好后，要趁熱及時涂抹封口。否則影響封閉效果。(七)貼標簽無論是裝干標本的紙袋，還是裝液浸標本的玻璃瓶，都需在其適當位置貼上正式標簽（標簽模版由指導老師提供）。對于紙袋，應貼在其右上角的位置；對于玻璃瓶，應貼在瓶體的中央位置。標簽的大小和位置，應根據(jù)具體的紙袋的大小和玻璃瓶的大小而定。同時，要兼顧標本袋或標本瓶的整體協(xié)調(diào)性和美觀性。（八）真菌永久玻片標本的制作 固定劑：70%酒精、福爾馬林、冰醋酸、FAA固定液、納瓦興氏固定液、鉻酸、醋酸固定液等。染色劑：天然染色劑：蘇木素、胭脂紅、地衣紅，在真菌染色中主要用蘇木素。 人

18、工染料：番紅O，固綠、結晶紫苯胺藍（棉藍）、酸性品紅等脫水劑：酒精、丁醇、甘油透明劑：二甲苯、氯仿、甲苯、香精油等粘貼劑：蛋白甘油粘貼劑、明膠粘貼劑、火棉膠粘貼劑等。浮載劑：水、乳酚油、希爾液、甘油、乳酸、3%氫氧化鉀等封藏劑：乳酚油、希爾液甘油、甘油、甘油明膠、聚乙烯醇膠。封固劑：中性樹膠、達瑪樹膠等。方法1：甘油明膠法微加熱除泡滴希爾液載玻片放入標本樹膠封片加小蓋玻片加熱溶化加甘油明膠希爾液（沙氏液：Shear）配方：醋酸鉀（2%）水溶液 300毫升 甘油 120毫升 酒精 180毫升甘油明膠配方：明膠 5克 甘油 35毫升 水 30毫升制成的甘油明膠，每100毫升可加苯酚1克，有的不加苯

19、酚。明膠在水中浸透，加熱至35熔化，加甘油和苯酚攪和，紗布過濾后盛在玻璃瓶中。方法2：聚乙烯醇（PVA）法：封藏劑和封固劑配方一：聚乙烯醇粉末2g 丙酮7ml 甘油5ml 乳酸5ml 水20ml配方二：聚乙烯醇粉末3g ，水20ml （水浴補足水）溶化母液，加等量乳酸及按母液1/10加甘油，攪勻即成。染液用苯胺藍或酸黃1g溶于100ml乳酸。 微加熱除泡滴希爾液載玻片放入標本加小蓋玻片樹膠封片加聚乙烯醇加聚乙烯醇（九）真菌臨時玻片的制作臨時玻片制作方法很多，如涂、撕、粘、挑和切片等，可以根據(jù)病原物的類型選擇使用。1）涂抹法：細菌和酵母菌的培養(yǎng)物常用涂抹法制片。將細菌或酵母菌的懸浮液均勻地涂在潔

20、凈的載玻片上，在酒精燈火焰上烘干、固定，再加蓋玻片封固。加蓋玻片前還可進行染色處理，使菌體或鞭毛著色而易于觀察。2）撕取法：用小金屬鑷子仔細撕下病部表皮或表皮毛制成臨時玻片。3）粘貼法：將塑料膠帶紙剪成邊長5mm左右的小塊（注意膠帶上不要印有指?。?，使膠面朝下貼在病部，輕按一下后揭下制成玻片。4）挑取法：用挑針從病組織或基物（如培養(yǎng)基）上挑取表面的霉狀物、粉狀物或孢子團制成玻片。5）組織透明法：將少量病組織材料切成細絲后放在載玻片上，滴加乳酚油后在酒精燈上徐徐加熱至蒸氣出現(xiàn)。如此處理數(shù)次使組織透明，冷卻后加蓋玻片進行鏡檢。此法可以觀察到病原物在寄主內(nèi)的原有狀態(tài)。6）徒手切片：徒手切片時選取病狀

21、典型、病征明顯的病組織材料，先在病征明顯處切取病組織小塊（邊長58mm），放在小木塊上，用食指輕輕壓住，隨著手指慢慢地后退，用刀片的刀尖將壓住的病組織小塊切成很薄的絲或片，用沾有浮載劑的挑針或接種針挑取薄而合適的材料放在一干凈載玻片上的浮載劑液滴中央，蓋上蓋玻片，仔細擦去多余的浮載劑（注意浮載劑過多會使觀察物出現(xiàn)晃動不穩(wěn)定現(xiàn)象），即制成一張臨時玻片。  浮載劑：水：溢菌、線蟲活動、真菌孢子萌發(fā)、大小測量。優(yōu)點：方便；缺點：產(chǎn)生氣泡；易干燥。乳酚油：除上述外均可用。優(yōu)點：殺菌固定、孢子膨脹復原、組織透明；缺點：不易封固、有毒。（十）線蟲永久玻片的制作永久玻片標本的制作方法比較復雜，所經(jīng)

22、過的步驟較多，時間較長。但是保存的時間也比較長，可使線蟲長時間保持原有狀態(tài)，是線蟲標本的重要保存方式。主要包括幾個步驟：殺死-固定-脫水-玻片制作，其中制備方法和試劑選擇不同，所制玻片中線蟲的蟲態(tài)和內(nèi)臟清晰度不同。 1.試劑 TAF固定液(三乙醇胺-福爾馬林固定液)福爾馬林(40甲醛) 7ml三乙醇胺(Triethanolamin) 2ml蒸餾水 91ml FG固定液(福爾馬林-冰醋酸) 福爾馬林(40甲醛) 8ml 甘油（丙三醇） 2ml 蒸餾水 90ml2 脫水液 甲溶液：福爾馬林（40%甲醛） 8ml 甘油（丙三醇） 2ml 蒸餾水 90ml 乙溶液：酒精(95) 95ml 甘油（丙三醇

23、） 5ml3 乳酸 配制45%的乳酸。2.線蟲的殺死與固定（1-1）常溫殺死與固定先將線蟲離心（2000r/min離心3min），用移液器吸出上清液，吸出的上清液要在體視顯微鏡下觀察，確保沒有線蟲被吸出，每管裝1ml的線蟲濃縮液，然后加入等量的FG固定液或TAF固定液。常溫下放置24h。（1-2）加熱殺死與固定將裝有線蟲的指型管放在離心機里，以2000r/min離心3min；用移液器吸出上清液，每管裝1ml的線蟲濃縮液；將TAF或FG固定液分裝在10ml指型管中，與線蟲濃縮液同時放在65的恒溫水浴鍋中加熱150s，加熱過程中不斷搖晃指型管，使線蟲液和固定液受熱均勻；將等量的固定液分別與線蟲懸液

24、混勻，注意動作要輕，常溫下放置24h。3.脫水（甘油酒精脫水法）參考武楊和劉斌的方法 6并做適當修改。將固定24h的線蟲放在離心機上2000r/min，離心3min；在體視顯微鏡下，用移液器小心將上清液吸出（注意不要將線蟲移出）；將剩余的線蟲懸液用移液器移至經(jīng)過消毒的染色皿中，并將染色皿傾斜放置，保證線蟲都聚集在一起；用移液器將甲溶液慢慢加入染色皿中，至染色皿的2/3處，染色皿傾斜放置，使線蟲盡量聚集在甲溶液的底部；在塑料盒或者干燥器中加入95%酒精，至容器的1/3處。將染色皿蓋上蓋子并保持原來狀態(tài)斜放在塑料盒或者干燥器的隔板上；將塑料盒蓋上蓋子并慢慢放進恒溫箱中，保持恒溫箱的溫度在35-43

25、，過夜。注意：在線蟲放入恒溫箱時將乙溶液一并置于恒溫箱中，防止操作過程中溫差變化過大；將過夜的染色皿移出并保持原來傾斜狀態(tài)，在體視顯微鏡下將甲溶液吸出，再慢慢加入乙溶液。蓋上蓋子并留點縫隙，傾斜放入加有純甘油的密封塑料盒或者干燥器中，41下，放置5h；將放置5h的染色皿取出，吸出乙溶液，向染色皿中加入幾滴純甘油，蓋上染色皿的蓋子，將染色皿置于加有純甘油的密封塑料盒中，41過夜；將過夜的染色皿的蓋子拿掉，并放回加有純甘油的密封塑料盒中，41下放置5h后，線蟲標本即可用于制作永久玻片；本方法采用濃度梯度脫水法，將線蟲逐級轉(zhuǎn)入濃度更高的甘油中，最后轉(zhuǎn)移至純甘油中，保證了在整個制片過程中蟲體所處環(huán)境的

26、連續(xù)性，避免了蟲體的變形和觀察效果的失真。本實驗過程中染色皿一直處于傾斜狀態(tài)是為了將線蟲聚集在皿低，盡量減少吸出溶液時將線蟲吸出。更換脫水液或者甘油時都要在體視顯微鏡下觀察線蟲是否因為脫水過快而變的干癟，若發(fā)生這種情況可重復前一步的脫水環(huán)節(jié)，這樣可使發(fā)生皺縮的線蟲標本在一定程度上得以恢復。4.永久玻片的制作參考JF Southey的方法7并做適當修改。（1）準備直徑1.5cm、長10cm的T型打孔器，低熔點的石蠟（熔點54）；（2）把打孔器端部在酒精燈火焰上加熱約10s，盡量使端部受熱均勻，趁熱迅速將打孔器端部插到蠟盤中蘸取少許石蠟；（3）將熔化的蠟盡快粘附在潔凈的載玻片中央。如果第一次蘸取的石蠟太少，可以按上述步驟重復2到3次5。待蠟圈凝固后即可使用；（4）用挑針蘸取一小滴純甘油放在蠟圈中央；（5）在體視顯微鏡用挑針將數(shù)條已脫水的線蟲挑至載玻片中央的浮載劑中，將載玻片置于體視顯微鏡下觀察，用挑針小心地將線蟲排勻，并使線蟲沉于浮載劑底部；（6）取干凈的蓋玻片，在體視顯微鏡下，輕輕蓋上蓋玻片，使蓋玻片置于蠟圈正上方；（7）待磁力攪拌器加熱至75左