蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究技術(shù)

1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究技術(shù)小組成員：王鵬、任楠楠、陳瑤、占希、宮婷婷主講人：xx蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究技術(shù) 1.X射線單晶衍射分析技術(shù) 2.核磁共振技術(shù) 3.蛋白質(zhì)的二維結(jié)晶及三維重構(gòu)技術(shù) 4.蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象的光譜技術(shù) 5.掃描探針顯微鏡技術(shù) 6.交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) 7.分子模擬技術(shù)X射線單晶衍射技術(shù)的原理 當(dāng)一束X射線照射到晶體上時(shí)，X射線在晶體中產(chǎn)生衍射現(xiàn)象。晶體所產(chǎn)生的衍射花樣都反映出晶體內(nèi)部的原子分布規(guī)律。 若用照相法收集衍射線，則可使膠片感光，留下相應(yīng)若用照相法收集衍射線，則可使膠片感光，留下相應(yīng)的衍射花樣的衍射花樣( (衍射光斑、衍射光環(huán)或衍射線條衍射光斑、衍射光環(huán)或衍射線條) ) 。 X射線晶體衍

2、射分析（Xray Crystallography）主要包括以下五個(gè)步驟： 1）晶體培養(yǎng) 2）數(shù)據(jù)收集和處理 3）測(cè)定相位 4）電子密度圖的計(jì)算和解釋 5）結(jié)構(gòu)模型修正 1）晶體培養(yǎng)。 結(jié)構(gòu)測(cè)定的精度依賴于晶體所能達(dá)到的衍射分辨率，所以獲得具有強(qiáng)衍射能力的晶體是蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定分析的關(guān)鍵步驟，是蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析的瓶頸。 2）數(shù)據(jù)收集和處理 一般來講，中等大小晶胞的一套高分辨率數(shù)據(jù)，至少要收集幾萬個(gè)衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)，再經(jīng)過專門的數(shù)據(jù)處理程序包處理，給出這一套數(shù)據(jù)的各種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以判斷數(shù)據(jù)質(zhì)量的好壞。 3）電子密度圖的計(jì)算和解釋 有了每個(gè)衍射點(diǎn)的相位，加上已經(jīng)收集到的每個(gè)衍射點(diǎn)的結(jié)構(gòu)振幅，就可計(jì)算電

3、子密度圖。由于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，它的電子密度圖隨著分辨率的不同，從圖上能識(shí)別出的結(jié)構(gòu)層次也不同。 4）結(jié)構(gòu)模型修正 從電子密度圖上最初建立的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)模型是比較粗糙的，需要進(jìn)一步精華。 英國(guó)生物化學(xué)家肯德魯（英國(guó)生物化學(xué)家肯德魯（John Cowdery Kendrew）和佩）和佩魯茲（魯茲（Max Ferdinand Perutz），用），用X-射線衍射分析法研射線衍射分析法研究血紅蛋白和肌紅蛋白，而且共同研究究血紅蛋白和肌紅蛋白，而且共同研究X-射線衍射晶體照射線衍射晶體照相術(shù)，以及蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)與功能。相術(shù)，以及蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)與功能。 1960年，他們把一些蛋白質(zhì)分子和

4、衍射年，他們把一些蛋白質(zhì)分子和衍射X-射線效率特別射線效率特別高的大質(zhì)量原子（如金或汞的原子）結(jié)合起來，首次精確高的大質(zhì)量原子（如金或汞的原子）結(jié)合起來，首次精確地測(cè)定了蛋白質(zhì)晶體的結(jié)構(gòu)?？系卖敽团弭敶姆窒砹说販y(cè)定了蛋白質(zhì)晶體的結(jié)構(gòu)?？系卖敽团弭敶姆窒砹?962年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 萊納斯萊納斯.鮑林（鮑林（Linus Carl Pauling）將）將X-射線衍射晶體結(jié)射線衍射晶體結(jié)構(gòu)測(cè)試的方法引入到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定中，并且推導(dǎo)了經(jīng)衍構(gòu)測(cè)試的方法引入到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定中，并且推導(dǎo)了經(jīng)衍射圖譜計(jì)算蛋白質(zhì)中重原子坐標(biāo)的公式。至今，通過蛋白射圖譜計(jì)算蛋白質(zhì)中重原子坐標(biāo)的公式。至今，通過蛋

5、白質(zhì)結(jié)晶進(jìn)行質(zhì)結(jié)晶進(jìn)行X-射線衍射實(shí)驗(yàn)仍然是測(cè)定蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的射線衍射實(shí)驗(yàn)仍然是測(cè)定蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要方法，人類已知結(jié)構(gòu)的絕大部分蛋白質(zhì)都是經(jīng)由這種主要方法，人類已知結(jié)構(gòu)的絕大部分蛋白質(zhì)都是經(jīng)由這種方法測(cè)定獲得的。方法測(cè)定獲得的。 結(jié)合血紅蛋白的晶體衍射圖譜，鮑林提出蛋白質(zhì)中的肽結(jié)合血紅蛋白的晶體衍射圖譜，鮑林提出蛋白質(zhì)中的肽鏈在空間中是呈螺旋形排列的，這是最早的鏈在空間中是呈螺旋形排列的，這是最早的螺旋結(jié)構(gòu)模螺旋結(jié)構(gòu)模型。型。 2000年，美國(guó)科學(xué)家阿格雷（年，美國(guó)科學(xué)家阿格雷（Peter Agre）與其他研究人）與其他研究人員應(yīng)用場(chǎng)發(fā)射電子源的電子衍射方法得到分辨率為員應(yīng)用場(chǎng)發(fā)射電子源

6、的電子衍射方法得到分辨率為3.8埃埃的的AQPl 水通道電子密度圖，發(fā)現(xiàn)了一種被稱為水通道蛋水通道電子密度圖，發(fā)現(xiàn)了一種被稱為水通道蛋白的細(xì)胞膜蛋白就是人們尋找已久的水通道，并公布了世白的細(xì)胞膜蛋白就是人們尋找已久的水通道，并公布了世界第一張水通道蛋白的高清晰度立體照片。界第一張水通道蛋白的高清晰度立體照片。 阿格雷和麥金農(nóng)因?yàn)閷?duì)膜蛋白分子和離子通道開創(chuàng)性的阿格雷和麥金農(nóng)因?yàn)閷?duì)膜蛋白分子和離子通道開創(chuàng)性的研究，而共同分享了研究，而共同分享了2003 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。核磁共振技術(shù) 核磁矩不為零的核在外磁場(chǎng)的作用下，核自旋能級(jí)發(fā)生塞曼分裂，共振吸收某一特定頻率的射頻（RF）輻射

7、，這一物理過程就是核磁共振。 滿足共振條件可以有兩種方法滿足共振條件可以有兩種方法一是固定電磁波的頻率而逐漸改變外加磁場(chǎng)，稱為掃場(chǎng)掃場(chǎng)另一種是固定磁場(chǎng)而改變電磁波的頻率，稱為掃頻掃頻。目前應(yīng)用最廣的是脈沖傅立葉變換的核磁共振技術(shù)。即應(yīng)用一個(gè)短時(shí)間方波脈沖激發(fā)樣品，這種方波中包含各種不同的頻率在內(nèi)，因此樣品中不同的核可在同一時(shí)間內(nèi)都得到激發(fā)。但是脈沖過后得到的是指數(shù)衰減的時(shí)域函數(shù)，借助Fourier變換的數(shù)學(xué)方法把時(shí)域函數(shù)轉(zhuǎn)換成頻域函數(shù)，這時(shí)就能見到已經(jīng)產(chǎn)生的若干共振峰，這種變化過程可以由計(jì)算機(jī)自動(dòng)完成。 一維核磁共振只能測(cè)定小分子的結(jié)構(gòu)如氨基酸，要測(cè)定大分子物質(zhì)就需要利用二維核磁共振以及多維核

8、磁共振。 一維核磁共振是在一個(gè)脈沖之后的t1時(shí)間進(jìn)行數(shù)據(jù)收集 二維核磁共振在t1時(shí)間后再加一個(gè)脈沖后在t2時(shí)間內(nèi)收集數(shù)據(jù)S（t1，t2），然后分別以t2和t1為變量進(jìn)行傅立葉變換就得到二維譜S（w1，w2）。二維譜就是把作為對(duì)角線的一維譜的峰進(jìn)一步分開。 核磁共振應(yīng)用于測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) 950年，Proctor等人研究發(fā)現(xiàn)：質(zhì)子的共振頻率與其結(jié)構(gòu)（化學(xué)環(huán)境）有關(guān)。在高分辨率下，吸收峰產(chǎn)生化學(xué)位移和裂分，由有機(jī)化合物的核磁共振圖，可獲得質(zhì)子所處化學(xué)環(huán)境的信息，進(jìn)一步確定化合物結(jié)構(gòu) 1971 年，比利時(shí)科學(xué)家J. Jeener 提出二維核磁共振的概念 1985年，Kurt Wthrich在此基礎(chǔ)

9、上發(fā)明了一種新的方法，他選擇生物大分子中的質(zhì)子(氫原子核)作為測(cè)量對(duì)象，連續(xù)測(cè)定所有相鄰的兩個(gè)質(zhì)子之間的距離和方位，這些數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后就可形成生物大分子的三維結(jié)構(gòu)圖 核磁共振技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：具有高分辨率，僅次于X- 射線晶體學(xué)技術(shù)，可以在溶液中操作，在近似蛋白質(zhì)生理環(huán)境下測(cè)定其結(jié)構(gòu)，甚至可以對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，獲得“活”的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：所能測(cè)定的樣品的分子量要比較小，一般在50KD以下。另外核磁共振衍射技術(shù)的反應(yīng)體系是溶液，這對(duì)不溶的蛋白比較困難，如膜蛋白，只有用去垢劑才能溶解，這就使研究復(fù)雜化。在核磁共振衍射的觀察中，去垢劑會(huì)造成很大的噪音和假相。實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，采用核磁

10、共振方法尋找蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較為耗費(fèi)人力及時(shí)間，尤其是圖譜分析工作極為困難和費(fèi)時(shí)。 蛋白質(zhì)三維電鏡重構(gòu)技術(shù) 在電鏡下觀察生物大分子時(shí)，觀察的對(duì)象是三維結(jié)構(gòu)，電鏡圖像是這些三維結(jié)構(gòu)的二維投影。由生物結(jié)構(gòu)的二維電鏡圖像推知其三維結(jié)構(gòu)的方法稱為三維電鏡方法 三維電鏡技術(shù)的新進(jìn)展：冷凍電子顯微鏡技術(shù) 冷凍電鏡三維重構(gòu)是結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的一種較新的技術(shù)。它的基本技術(shù)路線為：利用快速冷凍技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行冷凍固定，然后利用冷凍電鏡和低劑量成像技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行電子成像，利用高靈敏底片進(jìn)行成像記錄，利用高分辨率掃描儀對(duì)底片進(jìn)行數(shù)字化，對(duì)數(shù)字化的圖像進(jìn)行二維圖像分析選點(diǎn)、分類、校正和平均，最后完成樣品的三維重構(gòu)計(jì)算。 相對(duì)

11、于其他兩種成熟的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究手段X射線晶體學(xué)和核磁共振技術(shù),主要有以下一些優(yōu)勢(shì)： 1）可以直接獲得分子的形貌信息，即使在較低分辨率下，電子顯微學(xué)也可給出有意義的結(jié)構(gòu)信息； 2）適于解析那些不適合應(yīng)用X射線晶體學(xué)和核磁共振技術(shù)進(jìn)行分析的樣品，如難以結(jié)晶的膜蛋白，大分子復(fù)合體等； 3）適于捕捉動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化信息； 4）易同其他技術(shù)相結(jié)合得到分子復(fù)合體的高分辨率的結(jié)構(gòu)信息； 5）電鏡圖像中包含相位信息，所以在相位確定上要比X射線晶體學(xué)直接和方便。 三維電鏡重構(gòu)技術(shù)的缺點(diǎn)： 由于生物樣品易受輻照損傷、圖像襯度低、信噪比低的特點(diǎn)，它對(duì)生物大分子的高分辨率結(jié)構(gòu)解析非常困難。蟑螂濃核病毒通過冷凍電子顯微鏡技

12、術(shù)進(jìn)行的病毒 衣殼空間結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)分析蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象的光譜技術(shù)1.同步輻射圓二色光譜（SRCD）研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 采用同步輻射光源，可以將測(cè)定波長(zhǎng)低至160nm，從而提供低波長(zhǎng)的信息。而且，SRCD的真空紫外輻射不破壞蛋白質(zhì)短的整體性，并且有高的信噪比，更快的測(cè)量等特點(diǎn)，在高濃度緩沖液和其它吸附成分存在時(shí)仍可以完成樣品的檢測(cè)。2.紫外共振拉曼光譜和二維相關(guān)紅外光譜 共振拉曼光譜是在吸收區(qū)選擇激發(fā)樣品，在紫外區(qū)選擇激發(fā)蛋白質(zhì)分子的不同區(qū)域，開展蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究工作，很大程度地提高了拉曼散射截面，排除了熒光干擾，使光譜的信噪比顯著提高。 二維相關(guān)紅外光譜作為一種新的分析技術(shù)被用來分析蛋白質(zhì)的酰胺、

13、帶。此技術(shù)非常有用，因?yàn)槎S相關(guān)紅外光譜能夠按不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)將酰胺帶去卷積成各成分帶；能夠給予一個(gè)擾動(dòng)，通過選擇性的相關(guān)峰，將不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)；能夠提供各種環(huán)境下，二級(jí)結(jié)構(gòu)變化和氨基酸殘基變化的特有規(guī)律。掃描探針顯微鏡（SPM）技術(shù) SPM家族通常分為掃描隧道顯微鏡（STM）和原子力顯微鏡(AFM)兩大類。其成像及工作原理分別是檢測(cè)針尖和樣品之間的隧穿電流和相互作用力。 SPM具有很高的空間分辨率，可以原位實(shí)時(shí)成像，并且可以在一定條件下成原子級(jí)像。蛋白質(zhì)分子由于必須依靠一定的媒介環(huán)境才能保持其生物活性和化學(xué)活性，因而蛋白質(zhì)的成像通常是在特定的緩沖液中例如用AFM納米嫁接的方法，在添加了三氟乙醇的緩沖溶液中，將鐵硫金屬蛋白修飾到已經(jīng)組裝了硫醇的金電極上（如圖），圖中可以明顯的看出最高的蛋白質(zhì)分子，次高的硫醇自組裝膜區(qū)域以及金基底。納米嫁接的蛋白質(zhì)AFM三維形貌圖交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（CXMS） 核磁共振技術(shù)、X射線晶體衍射技術(shù)等，對(duì)于蛋白質(zhì)的純度、結(jié)晶性和絕對(duì)量均有比較高的要求，限制了其廣泛應(yīng)用，交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是近十年來發(fā)展起來的新技術(shù)，它將質(zhì)譜技術(shù)與交聯(lián)技術(shù)相結(jié)合，在研究