馬鈴薯蛋白酶抑制子StPI基因的克隆及表達(dá)分析

1、馬鈴薯蛋白酶抑制子StPI基因的克隆及表達(dá)分析李廣存1,2，金黎平1，謝開云1，李 穎1，屈冬玉1（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250100）摘要：【目的】克隆馬鈴薯蛋白酶抑制子基因StPI的全長cDNA。【方法】以馬鈴薯高抗青枯病二倍體基因型ED13為材料，采用RACE方法進(jìn)行StPI基因全長cDNA的克隆，利用半定量RT-PCR方法進(jìn)行該基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析?！窘Y(jié)果】獲得了StPI基因的全長cDNA，序列分析表明：該基因具有完整的開放閱讀框架，編碼116個(gè)氨基酸，與馬鈴薯蛋白酶抑制子 I 前體具有較高的同源性（核苷酸和氨基酸序

2、列同源性分別為89%和74%）。該基因同時(shí)受青枯病菌的誘導(dǎo)和茉莉酸的調(diào)節(jié)，在612 h內(nèi)即達(dá)到最高表達(dá)水平，但二者又有明顯不同。相對而言，StPI基因受青枯病菌的誘導(dǎo)較弱，而受茉莉酸（JA）的誘導(dǎo)較為強(qiáng)烈，在JA處理3 h表達(dá)量即明顯升高，612 h迅速升至最高?！窘Y(jié)論】本研究從馬鈴薯抗青枯病基因型ED13中獲得了StPI基因的全長cDNA。該基因可能參與了馬鈴薯的抗青枯病反應(yīng)，且病菌處理對該基因的誘導(dǎo)可能與JA刺激具有相似或相同的信號途徑。關(guān)鍵詞：馬鈴薯晚疫?。籖ACE；StPI基因；全長cDNA；基因表達(dá)Cloning and Expression Analysis of Proteina

3、se Inhibitor Gene StPI in Diploid PotatoLI Guang-cun1, 2, JIN Li-ping1, XIE Kai-yun, LI Ying, QU Dong-yu1(1 Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2Bio-Technology Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100)Abstract:【Objecti

4、ve】Experiments were performed to clone the full-length cDNA of potato proteinase inhibitor gene (stPI).【Method】RACE strategy was used to clone full-length cDNA of StPI from Ralstonia solanacearum (Rs) resistant potato genotype ED13. Rs and jasmonic acid (JA) induced expression patterns were analyzed

5、 by performing semi-quantitative RT-PCR. 【Result】A full-length cDNA of StPI with completed open reading frame of 116 amino acids was cloned. BLAST search against NCBI databases showed that the StPI gene shared 89% and 74% identity in nucleotide and amino acid sequence respectively with potato protei

6、nase inhibitorprecursor respectively. Analysis of semi-quantitative RT-PCR indicated that this gene was induced by Rs and as well as up-regulated by JA. The StPI gene expression reached the highest level in 12 hours after Rs inoculation or JA treatment, then leveled off. Moreover, quick mRNA accumul

7、ation after treatment suggested a strong induction by JA. 【Conclusion】StPI gene may function in potato resistance against R. solanacearum. The induction of StPI by R. solanacearum invasion may have a similar signal transduction pathway to that of JA treatment.Key words: Potato bacterial wilt; RACE;

8、StPI gene; Full-length cDNA; Gene expression0 引言【研究意義】由青枯病菌（Ralstonia solanacearum）引起的馬鈴薯青枯病是僅次于馬鈴薯晚疫病的世界性病害，嚴(yán)重影響著馬鈴薯的生產(chǎn)，目前尚缺少有效的化學(xué)藥劑防治辦法，分離和克隆抗青枯?。ㄏ嚓P(guān)）基因，并進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化以培育和篩選馬鈴薯抗青枯病品系（種）對于有效防治馬鈴薯青枯病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蛋白酶抑制子是一類小蛋白，幾乎存在于所有的生命體中，它不僅存在于植物種子、塊根、塊莖等儲(chǔ)藏器官中，也存在于非儲(chǔ)藏器官，如葉、花和根中1, 2。植物蛋白酶抑制子參與植物的抗病防御和植物內(nèi)源蛋

9、白酶的調(diào)節(jié)3, 4，其參與植物的抗病防御主要是通過抑制外來病原的蛋白酶或消化酶活性，導(dǎo)致外來病原在寄主體內(nèi)缺乏必需氨基酸的供應(yīng)而達(dá)到抗病防御的目的5。植物蛋白酶抑制子也可通過干擾外來病原的生理生化過程，如干擾病毒的復(fù)制、消化酶的活性等來起作用6。自第一個(gè)蛋白酶抑制子從大豆中分離出來后，現(xiàn)已有495個(gè)蛋白酶抑制子從129個(gè)不同的植物中被相繼分離和鑒定1。茉莉酸（jasmonic acid，JA）是一個(gè)重要的信號分子，在植物的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要的作用。JA不僅可誘導(dǎo)馬鈴薯的抗病反應(yīng)7，還可調(diào)節(jié)植物蛋白酶抑制子基因的表達(dá)8, 9?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】馬鈴薯抗青枯病機(jī)制比較復(fù)雜，并且長期以來人們對馬鈴

10、薯青枯病的研究和探討主要集中在病菌的病理學(xué)機(jī)制、分類學(xué)、流行病學(xué)等方面，而對于馬鈴薯本身的抗病遺傳特性、馬鈴薯青枯病抗性相關(guān)基因的分離及其表達(dá)調(diào)控途徑等方面的研究還開展得較少。目前分離和鑒定的少數(shù)與青枯病抗性相關(guān)的基因（座）的工作中，除幾個(gè)源自馬鈴薯（如AP1）外，未見其它相關(guān)的報(bào)道10?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了獲得馬鈴薯抗青枯病早期相關(guān)基因的表達(dá)情況，前期的研究已通過構(gòu)建抑制差減雜交文庫，獲得了StPI基因的EST片段。本文擬在此基礎(chǔ)上，采用快速擴(kuò)增cDNA末端（RACE）的方法從抗青枯病馬鈴薯基因型ED13中克隆StPI基因全長cDNA。同時(shí)，進(jìn)一步利用半定量RT-PCR方法研究其青枯病菌

11、和茉莉酸誘導(dǎo)表達(dá)模式，為今后研究該基因的確切功能奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料與處理 青枯病菌處理：采用莖枝菌液共培養(yǎng)法11接種處理二倍體馬鈴薯高抗青枯病基因型ED13（由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所馬鈴薯組保存），所用病原菌為青枯病菌小種3號（Biovar 2）PO41（由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所植保室提供）。分別于病原菌處理0、6、12、24、48、72和96 h時(shí)取樣，液氮冷卻后，80保存。ED13的親本E（原編號為：772102.37）來源于二倍體抗青枯病原始栽培種S. phureja和野生種S.vernei，含有青枯病抗性基因，其遺傳背景見文獻(xiàn)12。茉莉酸處理：取生長

12、正常、旺盛、整齊、無其它病蟲害的塊莖繁殖的ED13植株，待植株長至78片展葉時(shí)，用50 molL-1的JA進(jìn)行噴灑，同時(shí)以噴水作為對照，分別于0、3、6、12、24、36、48和72 h取樣，液氮冷卻后，80保存。Taq DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、各種生化試劑及試劑盒等分別購自Clontech公司、Invitrogen公司、Promega公司、TaKaRa公司、上海生工公司及北京天為時(shí)代公司等。1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成RACE cDNA的合成：采用TRIZOL Regent一步法抽提試劑盒（Invitrogen），依試劑盒說明書提取青枯病菌處理6 h和12 h的ED1

13、3葉片總RNA，等量混合后分光光度計(jì)測定其OD值，電泳檢測所提取總RNA的質(zhì)量。參照BD SMARTRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）的操作說明書，以1 g總RNA為模板，利用試劑盒提供的逆轉(zhuǎn)錄引物（3-CDS Primer A：5-AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTAC(T)30VN-3），在BD PowerScript 逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成3-RACE Ready cDNA第一鏈。半定量RT-PCR分析用樣品的cDNA合成：分別提取青枯病菌及水處理0、6、12、24、48、72、96 h，茉莉酸處理0、3、6、12、24、36、48和72

14、 h的馬鈴薯ED13植株葉片的總RNA，提取方法同上。采用Superscript（Invitrogen）逆轉(zhuǎn)錄酶，以oligo-dT（18）為引物（上海生工公司）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。1.3 RACE 依據(jù)構(gòu)建差減cDNA文庫獲得的StPI基因（即EST129）的5端核苷酸序列設(shè)計(jì)基因特異引物GSP-F：5 GGAGGGAAAGAGTATGCTCAAGTT 3。利用GSP-F和SMARTRACE試劑盒提供的Universal Primer A引物，參照試劑盒說明書進(jìn)行3-RACE PCR擴(kuò)增?；厥铡⒓兓禺怭CR擴(kuò)增產(chǎn)物并克隆測序，根據(jù)所獲的3端序列與已有EST的重疊區(qū)進(jìn)行拼接。1.4 青

15、枯病菌和茉莉酸誘導(dǎo)表達(dá)依據(jù)所獲得的StPI基因的cDNA全長序列，分別設(shè)計(jì)其正向和反向基因特異引物：RT-F：5 TGCTTT CTTGCTTCTTGCATC 3；RT-R：5 TTTAACAATG GCCTCCCAGTC 3。采用半定量RT-PCR方法研究其誘導(dǎo)表達(dá)模式。PCR擴(kuò)增條件為：94 3 min；94 30 s，54 30 s，72 30 s，1735個(gè)循環(huán)；72延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增的DNA條帶的亮度來判斷所分析基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。為使所分析基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)具有可比性，首先利用持家基因Actin的特異引物對所有不同時(shí)間點(diǎn)的c

16、DNA第一鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量調(diào)整不同時(shí)間點(diǎn)的cDNA第一鏈的起始濃度，使其趨于一致；其次，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增停止于指數(shù)增長期，使PCR擴(kuò)增為不飽和擴(kuò)增，保持所分析基因的起始差異。2 結(jié)果與分析 2.1 RACE分析 由于StPI基因已經(jīng)具有5末端，因此本研究只進(jìn)行了3-RACE的PCR擴(kuò)增，具體方案如圖1。 cDNA第一鏈cDNA first strand5-3- 重疊區(qū)Overlap region (100 bp)EST129 (128 bp) 3-RACE擴(kuò)增片段3RACE amplification fragmentGSP1AAAA-3TTTT-5圖1 RAC

17、E克隆全長StPI cDNA 策略 Fig. 1 Strategies for cloning the full-length cDNA of StPI by RACE取5 l 3-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖膠電泳（圖2）：3-RACE擴(kuò)增片段特異性較好，大小約為550 bp，去除接頭序列的45 bp，所擴(kuò)增cDNA的3端長短約為500 bp。2.2 序列分析將所得3-RACE的PCR產(chǎn)物克隆測序，去除載體序列和引物序列后，與StPI基因的5端序列進(jìn)行拼接。拼接后的序列再次在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，并與對應(yīng)StPI基因的5端序列的BLAST比對結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明：3-RA

18、CE產(chǎn)物與原有StPI基因的5端序列分屬于StPI基因的不同區(qū)域，3-RACE產(chǎn)物確為目標(biāo)片段。所獲得的StPI基因包含一個(gè)351 bp的開放讀碼框架（open reading frame，ORF），5端有18 bp的非翻譯區(qū)（un-translated region，UTR），3端具有完整的PolyA尾，PolyA上游有加尾信號AATAAAA 13，編碼區(qū)編碼116個(gè)氨基酸（圖3-A），5端具有蛋白酶抑制子基因的典型結(jié)構(gòu)域：信號肽和跨膜區(qū)。該基因在GenBank上注冊序列號為DQ822994。StPI與馬鈴薯蛋白酶抑制子前體cDNA序列（Accession No：DQ168314.1）有89

19、%的同源性，與其編碼的氨基酸序列（Accession No：AAZ94182.1）有74%的同源性（圖3-B）。氨基酸序列的同源性比對還表明，StPI 基因與馬鈴薯蛋白酶抑制子I前體的5端同源性較高，而與其3端同源性較低，可能是該類基因的5端較為保守，而其3相對是易變的。M 1bp4500300020001200800500200 M: DNA Marker；1: 3-RACE PCR 產(chǎn)物M: DNA Marker; 1: 3-RACE PCR product圖2 StPI cDNA 的3-RACE 結(jié)果Fig. 2 3-RACE results of StPI cDNA2.3 青枯病菌及茉

20、莉酸的誘導(dǎo)表達(dá)分析 為研究StPI基因是否受青枯病菌的誘導(dǎo)和茉莉酸的調(diào)節(jié)及它們是否具有相似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，本實(shí)驗(yàn)采用半定量RT-PCR的方法對其在不同時(shí)間點(diǎn)的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)了分析（圖4）。StPI基因同時(shí)受青枯病菌和茉莉酸的誘導(dǎo)，但二者又有明顯不同的表達(dá)模式：在青枯病菌誘導(dǎo)下，該基因的表達(dá)水平緩慢升高，6 h時(shí)其表達(dá)量尚無明顯變化，至12 h時(shí)其表達(dá)量明顯升至最高，然后緩慢回落到其自然低水平（圖4-A）；在茉莉酸的刺激下，StPI基因被強(qiáng)烈的誘導(dǎo)，處理3 h時(shí)，其表達(dá)量即明顯升高，612 h迅速升至最高，而后急劇下降（圖4-B）。相反在對照水處理中該基因的表達(dá)量沒有明顯變化（圖4-C）。說明正常情

21、況下該基因在植物體內(nèi)維持低水平表達(dá)，以調(diào)節(jié)其基本的代謝，當(dāng)受到病原入侵或非生物脅迫時(shí)，該基因受到進(jìn)一步的激活，從而表現(xiàn)出表達(dá)量的升高，推測該基因可能參與馬鈴薯抗青枯病的反應(yīng)，同時(shí)也說明對于該基因而言，病菌處理和JA刺激可能采用相似的或同一個(gè)信號途徑。3 討論克隆目的基因cDNA的方法有多種，以核酸雜交A170136201267333409496AAATAAAATAAAAGCAAA ATG GAG GGA AAG AGT ATG CTC AAG TTA TCT CAT GTG CTT GCT TTC TTG CTT M E G K S M L K L S H V L A F L L CTT GC

22、A TCA CTT TTT CAA TCA CTG ATG GCA AGA GAT TTG ATC AGT GAT GGC ATA GAA GTA CTG CAA L A S L F Q S L M A R D L I S D G I E V L QATT CTG GAA AAT GAA ATC CAA GAT GTA TTG TGC CCA GGT AAG CAA TCA TGG CCT GAA CTT GTT GGG I L E N E I Q D V L C P G K Q S W P E L V GAAG CCA GCA GAA TAT GCT AAG AAA ATA ATT GAG

23、AAG GAA AAT CCC ATA GCT CAT GAT ATT AGA GTT K P A E Y A K K I I E K E N P I A H D I R V TTA TTT CCT GGT ATG CTT AGG CCA TCT AAT TAT GTT TGT GGT AGA GTT TTT CTG GTT GTT GAC TGG L F P G M L R P S N Y V C G R V F L V V D WGAG GCC ATT GTT AAA ATT ACT CCC ATA ATG GGT TAATTAATTATTTTATGGGAACATTATGTTATGAAAA

24、ATAACTE A I V K I T P I M G *AAAGTGGAGATACTAAATATAGTGTCTTCATGTACTTTACTATTTCAAGATAAATAAAACTAATGTTCCTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAABStPI 19 MEGKSMLKLSHVLAFLLLASLFQSLMARDLISDGIEVLQI-LENEIQDVLCPGKQSWPEL 195 MEGKSMLKLSHVLAFLLLASLFQ LMARDLISDGIEVLQ+ +EN+ + V CPGKQSWPELPI-I 1 MEGKSMLKLSHVL

25、AFLLLASLFQPLMARDLISDGIEVLQLPVENDGEFVFCPGKQSWPEL 60StPI 196 VGKPAEYAKKIIEKENPIAHDIRVLFPGMLRPSNYVCGRVFLVVDWEAIVKITPIMG 366 VGK A YAK+IEKEN I H+LFPGM +P NYVCGRVFLVV+ +V+TP MGPI-I 61 VGKSAGYAKQVIEKENSIVHEVKLLFPGMPKPLNYVCGRVFLVVNFKLVVQVTPSMG 117推導(dǎo)氨基酸序列標(biāo)示于相應(yīng)核苷酸之下；加尾信號用黑體標(biāo)出；非編碼區(qū)用下畫線標(biāo)出；*標(biāo)示終止密碼子The nucleotid

26、e sequence is numbered on the left. The deduced amino acid sequence is shown below the corresponding nucleotide sequence. A putative polyadenylation signal is in bold. Un-translated region is underlined. Stop code indicated with *圖3 StPI基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列（A），StPI基因氨基酸序列與馬鈴薯蛋白酶抑制子前體氨基酸序列比 較（B）Fig. 3 Nu

27、cleotide sequence and the deduced amino acid sequence of StPI gene (A) and alignment of deduced amino acid sequence of StPI with potato proteinase inhibitorprecursor (B)技術(shù)為基礎(chǔ)的cDNA文庫篩選法是較為常用的一種方法。該方法較為繁瑣，假陽性率較高, 所得克隆有時(shí)不夠完整，但可避免PCR非特異性擴(kuò)增或錯(cuò)配, 因此仍然被認(rèn)為是一種準(zhǔn)確可靠的cDNA克隆方法而受到研究者的青睞。RACE（rapid amplification of

28、 cDNA ends）技術(shù)的提出為快速克隆全長cDNA提供了方便。該方法不需接頭連接合成雙鏈cDNA，而直接以單鏈cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，避免了合成雙鏈cDNA時(shí)轉(zhuǎn)錄本豐度差異的放大，對于獲得低豐度轉(zhuǎn)錄本的全長cDNA較為有效。RACE技術(shù)自1988年14首次報(bào)道以來，已被成功用于植物基因克隆中，如：獲取全長cDNA，制備篩選cDNA文庫的探針，克隆已知片段的旁側(cè)序列，分離調(diào)控元件或被選擇性剪接等特殊轉(zhuǎn)錄物等15, 16。合理的引物設(shè)計(jì)是RACE成功的關(guān)鍵，較高的GC含量（55%70%）和較高的Tm值（70以上）是提高PCR產(chǎn)物特異性的必要條件，設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量避開保守區(qū)，準(zhǔn)備材料時(shí)應(yīng)盡量選擇目的基因

29、高表達(dá)組織和高表達(dá)時(shí)間取材；遇到非特異性擴(kuò)增時(shí)應(yīng)進(jìn)一步利用巢式引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得特異目的產(chǎn)物。由于StPI基因的cDNA大小不到1 kb，且已經(jīng)通過構(gòu)建SSH文庫獲得了其5端的序列，因此本試驗(yàn)通過合理的設(shè)計(jì)引物快速獲得了該基因cDNA的全長。植物抵御病原的最好辦法是加強(qiáng)自身的防衛(wèi)能力。蛋白酶抑制子是植物體內(nèi)自然存在的病程相關(guān)蛋白，特別是在植物種子和一些受脅迫的特異組織中，植物受到病原侵襲時(shí)所發(fā)生的最為普遍的抗病防御反應(yīng)就是激活這些基因來賦予植物自然抵抗能力17, 18。利用蛋白酶抑制子基因，特別是源自植物的抑制子基因進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移創(chuàng)造具有抗病蟲性的工程植株具有廣闊的前景19，如轉(zhuǎn)Vign

30、a unguiculata的胰蛋白酶抑制子基因（trypsin inhibitor gene）的煙草植株具有對病蟲的廣譜抗性20。蛋白酶抑制子在植物對真菌侵染中的抗病防御及調(diào)節(jié)植物程序性細(xì)胞死亡中也具有重要作用21, 22。本研究所獲得的StPI基因與馬鈴薯蛋白酶抑制子I前體具有較高的同源性。推測StPI基因是馬鈴薯蛋白酶抑制子基因家族的成員，在馬鈴薯的抗青枯病的反應(yīng)中也可能具有重要作用。StPIActin 0 6 12 24 48 72 96hAStPIActin0 3 6 12 24 36 48 72hB 0 6 12 24 48 72 96hStPIActinCRT-PCR模板來源于不同

31、處理、不同接種時(shí)期樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈，并根據(jù)持家基因Actin在不同時(shí)間點(diǎn)樣品的PCR擴(kuò)增量來調(diào)整RT-PCR的起始模板用量。圖的上方標(biāo)出了處理后取樣的不同時(shí)間點(diǎn)。A：青枯病菌誘導(dǎo)處理的樣品。B：茉莉酸誘導(dǎo)處理的樣品。C：對照水處理的樣品cDNA was synthesized from total RNAs of different samples harvested at different time points. Primers for Actin gene were used to verify that the quantity of cDNA template

32、 for each sample was equal. Different time points are indicated on the top of the figure. A: inoculated with Ralstonia solanacearum. B: treated with jasmonic acid. C: treated with water圖4 馬鈴薯葉片中StPI基因的RT-PCR分析Fig. 4 RT-PCR analysis of transcript levels of StPI gene in potato leaves在植物的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中研究的較為深入

33、的兩個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為水楊酸（SA）途徑和茉莉酸/乙烯（JA/Et）途徑，二者在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中既有重合又相對獨(dú)立23。但目前人們對SA在馬鈴薯的抗病反應(yīng)中所起的作用尚不十分清楚，研究表明：JA對于馬鈴薯晚疫病的基本抗性（basal resistance）是非常重要的7。植物蛋白酶抑制子在馬鈴薯葉片中的表達(dá)存在兩個(gè)獨(dú)立的調(diào)控途徑：JA途徑24和ABA途徑17，但JA和ABA又可對于某些基因進(jìn)行協(xié)同調(diào)節(jié)，這依賴于具體的基因和反應(yīng)23, 25。StPI基因在馬鈴薯中同時(shí)受青枯病菌的誘導(dǎo)和JA的調(diào)節(jié)，均為上調(diào)。但相對而言，該基因受JA的誘導(dǎo)更為強(qiáng)烈，在JA的刺激下其表達(dá)量迅速升高，而后急劇下降，這可能與

34、JA的作用方式及本試驗(yàn)中直接用其噴灑葉片有關(guān)。相反在用青枯病菌處理時(shí)，誘導(dǎo)較弱可能是由于莖枝接觸病菌菌液為葉片的遠(yuǎn)端所致。推測在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中青枯病菌侵染刺激與JA處理可能共用某一成分，或采用相似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)，但StPI基因是否也受SA的調(diào)節(jié)或受JA-ABA的協(xié)同調(diào)節(jié)及其在植物中的詳細(xì)功能及確切轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚需進(jìn)一步探討。4 結(jié)論本研究通過RACE方法從馬鈴薯高抗青枯病基因型ED13中克隆了StPI基因的全長cDNA。該基因具有完整的開放閱讀框架，編碼116個(gè)氨基酸，5端具有信號肽和跨膜區(qū)；RT-PCR分析表明該基因受青枯病菌的誘導(dǎo)，同時(shí)也受茉莉酸的調(diào)節(jié)，為進(jìn)一步研究該基因的確切功

35、能奠定了基礎(chǔ)。References1De Leo F, Volpicella M, Licciulli F, Liuni S, Gallerani R, Ceci L R. PLANT-PIs: a database for plant protease inhibitors and their genes. Nucleic Acids Research, 2002, 30: 347-348.2Sin S F, Chye M L. Expression of proteinase inhibitor II proteins during floral development in Solanu

36、m americanum. Planta, 2004, 219: 1010-1022.3Birk Y. Plant protease inhibitors: significance in nutrition, plant protection, cancer prevention and genetic engineering. Springer, Berlinpp, 2003: 170.4Mosolov V V, Grigoreva L I, Valueva T A. Plant proteinase inhibitors as multifunctional proteins. Appl

37、ied Biochemistry and Microbiology, 2001, 37: 643-650.5De Leo F, Gallerani R. The mustard trypsin inhibitor 2 affects the fertility of Spodoptera littoralis larvae fed on transgenic plants. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 32: 489-496.6Gutierrez-Campos R, Torres-Acosta J A, Saucedo-Ar

38、ias L J, Gomez-Lim M A. The use of cysteine proteinase inhibitors to engineer resistance against potyviruses in transgenic tobacco plants. Nature Biotechnology, 1999, 17: 1223-1226.7Halim V, Vess A, Scheel D, Rosahl S. The role of salicylic acid and jasmonic acid in pathogen defence. Plant Biology,

39、2006, 8: 307-313.8Orozco-Cardenas M L, Ryan C. Nitric oxide negatively modulates wound signaling in tomato plants. Journal of Plant Physiology, 2002, 130: 487-493.9Chen J, Liu J, Guo L, Qu L, Chen Z, Gu H. Inducible expression pattern of rice Bowman-Birk inhibitor gene Os WIP1-2 and its protease inh

40、ibitory activity. Chinese Science Bulletin, 2004, 49(9): 895-899.10Feng J, Yuan F, Gao Y, Liang C, Xu J, Zhang C, He L. A novel antimicrobial protein isolated from potato (Solanum tuberosum) shares homology with an acid phosphatase. Biochemical Journal, 2003, 376: 481-487.11李廣存, 金黎平, 謝開云, 龐萬福, 卞春松,

41、段紹光, 屈冬玉. 馬鈴薯青枯病抗性鑒定新方法. 中國馬鈴薯, 2006, 3: 129-134.Li G C, Jin L P, Xie K Y, Pang W F, Bian C S, Duan S G, Qu D Y. A new identification method for Ralstonia solanacearum resistance in potato (Solanum tuberosum L.). Chinese Potato Journal, 2006, 3: 129-134. (in Chinese)12Qu D Y. Use of unreduced gamete

42、s of potato (Solanum tuberosum L.) for true potato seed production through 4x-2x crosses. Wageningen: Plant Breeding, 1996: 104.13Rothnie H M. Plant mRNA 3-end formation. Plant Molecular Biology, 1996, 32(1-2): 43-61.14Frohman M A, Dush M K, Martin G R. Rapid production of full-length cDNAs from rar

43、e transcripts: Amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1988, 85: 8998-9002.15Lingle S E, Dyer J M. Cloning and expression of sucrose synthase-1 cDNA from sugarcane. Journal of Plant Physiology, 2001, 158(1): 129-1

44、31.16Reddy M K, Nair S, Singh B N, Mudgil Y, Tewari K K, Sopory S K. Cloning and expression of a nuclear encoded plastid specific 33 kDa ribonucleoprotein gene (33RNP) from pea that is light stimulated. Gene, 2001, 263(1-2): 179-187.17Fan S G, Wu G J. Characteristics of plant proteinase inhibitors and their applications in combating phytophagous insects.