非洛地平對(duì)氧化損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

1、非洛地平對(duì)氧化損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用         11-01-05 14:48:00     編輯：studa20                  作者：祁杰，盛嬰，鄭見寶，袁祖貽【摘要】  目的 研究非洛地平(felodipine)對(duì)氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)損傷的人臍靜脈內(nèi)

2、皮細(xì)胞(HUVECs)活性氧(ROS)及細(xì)胞間粘附分子1(ICAM1)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM1)mRNA表達(dá)的影響，探討其獨(dú)立于降血壓外的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。方法 篩選oxLDL與HUVECs細(xì)胞孵育最適的干預(yù)濃度梯度與時(shí)間，然后與不同濃度的非洛地平(0.1、1、10mol/L)共同孵育24h，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS，real timePCR檢測(cè)細(xì)胞ICAM1、VCAM1mRNA的表達(dá)。結(jié)果 oxLDL對(duì)HUVECs內(nèi)ROS的產(chǎn)生呈濃度依賴效應(yīng)，隨著刺激濃度的升高，ROS產(chǎn)生增多，25mg/L oxLDL作用最為顯著(P<0.01)，非洛地平可抑制oxLDL誘導(dǎo)的HUV

3、ECs ROS(P<0.05)的產(chǎn)生;隨oxLDL刺激濃度的增加，ICAM1、VCAM1 mRNA表達(dá)逐漸上調(diào)，當(dāng)濃度達(dá)到25mg/L時(shí)，作用最為顯著(P<0.05)，非洛地平可下調(diào)ICAM1、VCAM1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 非洛地平可抑制oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs ROS的產(chǎn)生以及下調(diào)ICAM1、VCAM1 mRNA表達(dá)，發(fā)揮抗氧化抗炎的內(nèi)皮保護(hù)功能。 【關(guān)鍵詞】  非洛地平;氧化型低密度脂蛋白;氧化應(yīng)激;動(dòng)脈粥樣硬化;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞間粘附分子1;血管細(xì)胞粘附分子1ABSTRACT: Objective To investigate t

4、he protective effect of felodipine on reactive oxygen species (ROS) generation, mRNA level of inflammatory factors such as intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) and vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1), in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injured by oxidized lowdensity lipoprot

5、ein (oxLDL) so as to explore felodipines antiatherosclerosis mechanism independent of its antihypertensive effect. Methods Isolated HUVECs were treated with oxLDL at different concentrations (6, 12.5 and 25mg/L) for 24 hours so that the optimal concentration and time of oxLDL treatment were selected

6、. Then the cells were incubated with oxLDL and treated with felodipine at different concentrations (0.1, 1 and 10mol/L). Intracellular ROS level was determined by flow cytometry (FCM). Expressions of inflammatory factors ICAM1 and VCAM1 were measured by real timepolymerase chain reaction (real timeP

7、CR). Results ROS generation was increased in HUVECs after treatment with different concentrations (6, 12.5 and 25mg/L) of oxLDL for 24 hours and there was a significant difference at 25mg/L oxLDL (P<0.01); ROS generation was decreased after felodipine treatment for 24 hours (P<0.05). The mRNA

8、expression of ICAM1 and VCAM1 in HUVECs during treatment with 25mg/L oxLDL was significantly higher than that in the control group (P<0.05), but ICAM1 mRNA and VCAM1 mRNA expressions were significantly downregulated during treatment with 0.1mol/L felodipine (P<0.05). Conclusion Felodipine has

9、an antiatherosclerosis endothelial protective effect. The antioxidation and antiinflammation mechanism may be related to its inhibiting HUVECs ROS generation induced by oxLDL as well as downregulating ICAM1 and VCAM1mRNA expressions.KEY WORDS: felodipine; oxidized lowdensity lipoprotein (oxLDL); oxi

10、dative stress; atherosclerosis; human umbilical vein endothelial cell; intercellular adhesion molecule1 (ICAM1); vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程1。但是，其發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚。近年來(lái)，從信號(hào)傳導(dǎo)和基因調(diào)控水平的研究揭示了氧化應(yīng)激和炎癥是As發(fā)生的兩個(gè)關(guān)鍵成分。這兩個(gè)看似不相關(guān)的獨(dú)立致病因素卻是相互調(diào)控,共同存在的。鈣通道阻滯劑獨(dú)立于降壓以外的多效作用備受

11、關(guān)注,其中抗As作用尤其受到重視。非洛地平(felodipine)是第2代長(zhǎng)效1，4二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，已作為高血壓病的首選藥物在臨床廣泛應(yīng)用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)非洛地平可減輕高脂飲食喂養(yǎng)的兔主動(dòng)脈粥樣硬化病變2。本實(shí)驗(yàn)試從細(xì)胞水平探討非洛地平的抗As作用及可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料 M199培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物研究所;非洛地平原粉、溶劑二甲亞砜(DMSO)、2，7二氯熒光素二乙酸脂(DCFHDA)購(gòu)自Sigma公司;總RNA提取試劑(Trizol)購(gòu)自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒為美國(guó)Promega公

12、司產(chǎn)品;兔抗人因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司;DNA熒光染料(SYBR Green)購(gòu)自TaKaRa公司;引物由上海生物工程有限公司合成;其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。本實(shí)驗(yàn)選用原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)，標(biāo)本來(lái)自于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科正常足月妊娠娩出的新生兒臍帶。于無(wú)菌條件下剪下臍帶放入無(wú)菌容器中，3h內(nèi)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)。置于50mL/L CO2、37培養(yǎng)箱中孵育，待原代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%90%融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將原代和傳至第3代的內(nèi)皮細(xì)胞懸液接

13、種于蓋玻片上，待細(xì)胞均勻鋪滿孔底吸出培養(yǎng)液，用PBS沖洗蓋玻片，冷風(fēng)吹干后-20低溫冰箱中凍存，用于因子相關(guān)抗原的檢測(cè)。第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。氧化型低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein, oxLDL)的制備：采用一次性密度梯度超速離心法分離LDL。新鮮健康人血漿購(gòu)自血庫(kù)。血漿在密度為1.063和1.020的密度梯度液中，于4、50000r/min離心5h。分離出的LDL在4的LDL透析液中透析36h，用0.45m微孔濾膜除菌保存。將已氧化的LDL在無(wú)EDTA的PBS中4透析36h，然后加入含CuSO4 PBS液，37氧化18h。再置于PBS液中透析24h。

14、于4避光保存，備用。用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定LDL和oxLDL的純度。用硫代巴比妥酸反應(yīng)法測(cè)定LDL和oxLDL的丙二醛含量以確定其氧化修飾程度。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取第3代HUVECs于37、50mL/L CO2培養(yǎng)箱孵育，然后傳代、消化，接種在6孔培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合約80%后，換成含100mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，應(yīng)用不同濃度的oxLDL孵育3代細(xì)胞，同時(shí)加用不同濃度的非洛地平進(jìn)行干預(yù)，孵育24h。實(shí)驗(yàn)分組：空白組：M199培養(yǎng)基與100mL/L胎牛血清;oxLDL組(As模型)：分別加入oxLDL 6、12.5、25mg/L孵育24h;非洛地平組：0.1

15、、1、10mol/L非洛地平分別與25mg/L oxLDL孵育24h;溶劑對(duì)照組：DMSO。1.2.2 內(nèi)皮細(xì)胞因子相關(guān)抗原的檢測(cè) 采用免疫熒光染色。取出凍存的蓋玻片，加入40g/L多聚甲醛固定30min，PBS沖洗，滴加110兔抗人因子抗體血清，再滴加1100熒光素標(biāo)記的羊抗兔免疫熒光抗體，同時(shí)設(shè)陰性及空白對(duì)照。熒光顯微鏡下觀察、拍照。1.2.3 細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)的測(cè)定 按照11000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFHDA;去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFHDA 1mL;37細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，以CE

16、LL QuestTM軟件分析平均熒光強(qiáng)度。     11-01-05 14:48:00     編輯：studa201.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞間粘附分子1(ICAM1)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM1)mRNA的表達(dá) RNA的提?。簠⒄誘rizol試劑盒說(shuō)明書提取RNA，所用器皿均用1g/L DEPC水處理，以防止RNA酶污染;逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：按照Promega逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;引物的設(shè)計(jì)與合成：擴(kuò)增引物序列為：GAPDH正義引物5CTCTCTGCTC

17、CTCCTGTTCGACAG3，反義引物5GTGGAATCATATTGGAACATGTAG3;ICAM1正義引物5CCGGAAGGTGTATGAACGT3，反義引物5TCCATGGTGATCTCTCCTC3;VCAM1正義引物5GGGACCACATCTACGCTGACAA3，反義引物5GGCCACTCAAATGAATCTCTGGA3;實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增目的基因ICAM1、VCAM1：20L反應(yīng)體系在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為95 5min，58.5 15min，72 10min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)以采集到的每一循環(huán)反應(yīng)時(shí)各反應(yīng)管的熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行分析。1.3 統(tǒng)計(jì)

18、學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)采用比較閾值法分析處理。2 結(jié) 果2.1 培養(yǎng)的HUVECs形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞接種24h后，倒置顯微鏡下，培養(yǎng)細(xì)胞為單層，呈鋪路石狀鑲嵌排列。細(xì)胞為扁平多角形，邊界清楚，胞質(zhì)豐富。細(xì)胞核為圓形或橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏空亮，核仁12個(gè)(圖1)。傳代細(xì)胞較原代生長(zhǎng)旺盛，可見多個(gè)雙核及核分裂細(xì)胞，有時(shí)可見多核及巨細(xì)胞。圖1 高倍鏡下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)Fig.1 Morphous of HUVECs under highpow

19、er lens (×200)2.2 原代及傳代血管內(nèi)皮細(xì)胞中因子相關(guān)抗原 熒光顯微鏡下可見培養(yǎng)的HUVECs胞質(zhì)內(nèi)有黃綠色熒光，證實(shí)人因子相關(guān)因子的存在(圖2)。2.3 不同處理組細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生 采用流式細(xì)胞儀測(cè)定不同處理組細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(圖3)。結(jié)圖2 熒光顯微鏡下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)因子的表達(dá)Fig.2 Expression of factor of HUVECs under fluorescence microscope (×200)果顯示：oxLDL對(duì)HUVECs內(nèi)ROS產(chǎn)生呈濃度依賴效應(yīng)，隨著刺激濃度的升高，ROS產(chǎn)生增多;當(dāng)25mg/L oxLDL作用2

20、4h后，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯增加(P<0.01)。溶劑對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS含量無(wú)明顯改變(P>0.05，圖4A)。非洛地平與oxLDL共孵育24h后，各濃度組均可抑制ROS的產(chǎn)生，以0.1mol/L作用最為顯著(P<0.01，圖4B)。2.4 oxLDL及非洛地平對(duì)HUVECs的ICAM1，VCAM1 mRNA表達(dá)的影響 隨oxLDL濃度的增加，ICAM1、VCAM1 mRNA表達(dá)逐漸上調(diào)，呈濃度依賴性;當(dāng)濃度達(dá)到25mg/L時(shí)，作用最為顯著，分別為對(duì)照組的(2.24±0.25)、(2.69±0.38)倍(P<0.05，表1)。不同濃度的非洛地平均可抑

21、制25mg/L oxLDL刺激下HUVECs ICAM1、VCAM1 mRNA的表達(dá)，且以低濃度作用顯著，分別為對(duì)照組的(0.46±0.12)、(0.38±0.13)倍(P<0.05，表2)。表1 不同濃度oxLDL作用下ICAM1、VCAM1 mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)以2-CT表示。*P<0.05，與溶劑對(duì)照組比較。表2 非洛地平對(duì)HUVECs的ICAM1、VCAM1 mRNA表達(dá)的影響3 討 論在As和急性冠狀動(dòng)脈綜合征有關(guān)的心血管功能障礙的發(fā)生和發(fā)展中，氧化應(yīng)激起主要作用。研究表明，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的氧化還原反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要化學(xué)過(guò)程之一，而且產(chǎn)生的

22、ROS是心血管疾病中重要的危險(xiǎn)因子之一，參與包括細(xì)胞炎癥在內(nèi)的多種病理過(guò)程。在病理?xiàng)l件下或衰老時(shí)ROS的增加超過(guò)細(xì)胞初級(jí)抗氧化防御能力時(shí)，可引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡，引起組織損傷及疾病發(fā)生。這是體內(nèi)氧化和抗氧化失去平衡的結(jié)果3。oxLDL可增強(qiáng)釋放ROS引發(fā)氧化應(yīng)激效應(yīng)加速As病理生理過(guò)程4。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度的oxLDL可使HUVECs內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，且呈濃度依賴性，而正常對(duì)照組內(nèi)的ROS呈低水平。以往文獻(xiàn)報(bào)道高濃度的oxLDL(50、100、200mg/L)可增加ROS的生成。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用低濃度oxLDL(6、12.5、25mg/L)作用HUVECs，同

23、樣可使ROS產(chǎn)生增加，損傷內(nèi)皮;而同時(shí)加用非洛地平后可明顯抑制ROS產(chǎn)生，且以低濃度作用顯著。表明降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度可減少ROS的產(chǎn)生，減輕細(xì)胞損傷。提示細(xì)胞內(nèi)Ca2+負(fù)荷與ROS的產(chǎn)生有關(guān)。As病變發(fā)生發(fā)展直至最終血栓形成的各個(gè)階段，炎性反應(yīng)起著重要的作用。目前，在As發(fā)病中研究較多的主要有ICAM1和VCAM1。研究表明，oxLDL能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞上調(diào)ICAM1的表達(dá)，介導(dǎo)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附56。王斌等7研究表明，oxLDL可損害內(nèi)皮細(xì)胞的功能，增加內(nèi)皮細(xì)胞ICAM1的表達(dá)。有大量證據(jù)表明，黏附分子所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)參與As及心肌梗死的病理過(guò)程8。在As形成早期，VCAM1主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞。大多數(shù)研究表明，oxLDL可誘導(dǎo)VCAM1在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。近年來(lái)，人們對(duì)ICAM1、VCAM1在As中表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制進(jìn)行了深入探討，認(rèn)為ROS作為中介，激活核轉(zhuǎn)錄因子NFB，加強(qiáng)ICAM1、VCAM1的轉(zhuǎn)錄9。ROS和促炎癥細(xì)胞因子間通過(guò)NFB形成惡性循環(huán)，不斷地促使促炎癥因子和