RACE原理及應用

1、RACE勺簡介 目前,全長基因的獲得是生物工程及分子生物學研究的一個重點。 盡管已經(jīng)有多種方法可以獲得基因的全長序列， 但在很多生物研究中， 由于所研究的目的基因豐度較低，從而使得由低豐度mRNA1過轉(zhuǎn)錄獲得全長cDNAf艮困難。 近年來發(fā)展成熟的cDNA端快速擴增(RACE贖術(shù)為從低豐度轉(zhuǎn)錄快速獲得全長cDNA提供了一個便捷的途徑。 cDNA末端快速擴增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技術(shù)是一 種基于mRNAe轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)建立起來的、以部分的已知區(qū)域序列為起點，擴增基因轉(zhuǎn)錄本的未知區(qū)域，從而獲得mRNA(cDNA)整序列的方法。簡單的說就是一種從低豐

2、度轉(zhuǎn)錄本中快速增長cDNA5和cDNA3末端，進而獲得獲得全長cDNAW單而有效的方法，該方法具有快捷、方便、高效等優(yōu)點，可同時獲得多個 轉(zhuǎn)錄本。因此近年來RAC豉術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的cDN庫篩選技術(shù)，成為克隆全長cDNAff列的常用手段。 第二RACE的原理 RACE是采用PCR技術(shù)由已知的部分cDNA順序來擴增出完整cDNA5和3末端，是 一 種 簡 便 而 有 效 的 方 法，又 被 稱 為 錨 定PCR(anchoredPCR)和 單 邊PCR(one2sidePCR)。 3RACE勺原理 一)加入oligo(dT)17和反轉(zhuǎn)錄酶對mRNAS行反轉(zhuǎn)錄得到(-)cDNA; 二)以olig

3、o(dT)l7和一個35bp的接頭(dT17-adaptor)為引物， 其中在引物的接頭中有一在基因組DNA中罕見的限制酶的酶切位點。這樣就在未知cDNA*：端接上了一段特殊的接頭序列。再用一個基因特異性引物(3amp)與少量第一鏈(-)cDNA退火并延伸，產(chǎn)生互補的第二鏈(+)cDNA。 三)利用3amp和接頭引物進行PCR1環(huán)即可擴增得到cDNW鏈。 擴增的特異性取決于3amp的堿基只與目的cDNA子互補.而用接頭引物來取代dT17一adaptor則可阻止長(dT)堿基引起的錯配。 5RACE勺原理 5RACE13RACE略有不同。 首先， 引物多設計了一個用于逆轉(zhuǎn)錄的基因特異引物GSP-

4、RT其次，在酶促反應中增加了逆轉(zhuǎn)錄和加尾步驟，即先用GSP-R逆轉(zhuǎn)錄mRN順得第一鏈（-）cDNA后，用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶和dATP在cDNA5端加poly（A）尾，再用錨定引物合成第二鏈（+）cDNA,接下來與3RACES程相同。用接頭引物和位于延伸引物上游的基因特異性引物（5amp）進行 PCRT增。圖13RACE的原理圖 3AACE-PCR mlvmalmlvmal辱n9fprtmvrn9fprtmvr O4nAtur;annualarhO4nAtur;annualarhorprimxorprimx PQHwrlhiEarlPQHwrlhiEarl OimJcnnchnTpfirmr

5、sOimJcnnchnTpfirmrs Afidl，riM，RmMh PW0JCPWL，(MAAMAXMnQfWi 3fWMDhlA*nHTP2Tb PCfiwWQUMMOWuwigEAtadgMAmtarPFVWandiMMGg flapwt17prtmarrf*CflprwMrf LrtrtgAUW1.aUAF.皿 全長cDNA勺獲得 通過RAC昉法獲得的雙鏈cDNA用限制性內(nèi)切酶酶切和southem印跡分析并克隆。通常的克隆方法是同時使用一個切點位于接頭序列上的限制性內(nèi)切酶和一個切點位于擴增區(qū)域內(nèi)的內(nèi)切酶。由于大多數(shù)非特異性擴增的cDNAT物不 能被后一個限制性內(nèi)切酶酶切，因而也就不會被

6、克隆.從而增加了克隆的選擇效率。還可以用在基因特異性引物的5端摻人一個限制性內(nèi)切酶的酶切位點的方法來克隆。最后， 從兩個有相互重疊序列的3和5RAC于物中獲得全長cDNA或者通過分析RACE物的3和5端序列，合成相應引物來擴增mRNA勺反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而獲得全長cDNA 第三RACE的應用 RAC豉術(shù)主要是應用于對全長cDNAff列的獲得，但對該技術(shù)進行一定的修改后，也可在其它方面顯示出極高的應用價值。 首先，RAC豉術(shù)可用于cDNAt庫的構(gòu)建及篩選。Belyavaasky等(1989)用10個骨髓瘤細胞分離的總RNA通過TdT加同聚尾、(dT)16引物反轉(zhuǎn)錄， 接著用(dC)13和錨定引物擴增

7、的方法建立了一個106克隆的cDNA文庫。同時，用該 方法構(gòu)建文庫的優(yōu)點是它們都只需要很少量的實驗材料。建喜等(2001)利用 RAC豉術(shù)從已經(jīng)構(gòu)建的cDNA文庫中成功克隆了家兔精子膜蛋白基因。 Eitmnd pmwMFtBe 臥承 CmrURHAmCCWLf*RT 圖2TRACE的原理圖 其次， 應用RACES隆已知片段的旁側(cè)內(nèi)部序列(neighboringinternalsequence)0Fritz等(1991)以及Struck等(1994)分別用該法獲得了3端和5端的旁側(cè)序列。Zhang(1996)應用LA-PCR方法獲得了特異基因的5末端非編碼和編碼序列， 省去了構(gòu)建及篩選基因組文庫

8、的麻煩。王東等(2003)利用RT-PCR 和RACEK術(shù)從玉米中獲得一個長度為2469bpF2KP蛋白基因的cDNM隆。止匕外，RAC豉術(shù)還可用于克隆同源基因的同源片斷，為尋找同基因提供了一種方法。 除此之外,Whitcomb等設計的隨機引物/錨定PC難對克隆質(zhì)粒載體上的靶序列進行定點刪除， 采用(N)10錨隨機引物和變性的質(zhì)粒DNA!行雜交， 然后通過T7聚合酶來延伸，這樣單鏈DNAft可被一隨機引物和一基因特異性引物擴增，一端可達到缺失刪除， 缺失的片段可達2KboBalavoine應用連接介導PCRR一種扁蟲中克隆得到8個分別屬于Hox,msh,NK-1和NK-2的含同源盒的片段，說明

9、RAC而用于克隆同源基因的同源片段，為尋找同源基因提供了一種手段。 RAC鼓術(shù)與生物信息學，例如ESTB相結(jié)合，具有快速，高效克隆新基因的特點,為快速釣取基因家族候選新成員提供新思路，如果一個基因是多基因家族的一個成員，用基因特異引物(GSP)可能同時擴增幾個高度同源的Cdna.李紅等利用一條cDNA乍為探針， 通過BLASTNAGenBank中整合出了7條更長的EST,通過設計引物，利用RACET增,得到了7條新基因.相比單純尋找新基因的全長，此種方法的結(jié)合充分利用了信息巨大的基因資源庫，得到了更多的信息，獲得新基因速度更快*效果更高，屬一種頗具規(guī)模化的方法，很有應用前景。 總之，隨著RAC

10、豉術(shù)的不斷改進和完善，優(yōu)化PCFT增的條件以提高擴增的效率和忠實性,RAC鼓術(shù)必將在基因克隆以及基因家族和基因表達變化等研究中發(fā)揮極大的作用。 第四RACE的優(yōu)點與局限性 RAC鼓術(shù)相對于其他方法克隆全長cDN林說具有價廉、簡單和快速等特點。用RACEK彳導cDNA隆只需幾天的時間， 而且對豐度很低的起始反應物質(zhì)， 照樣能迅速反饋是否有目的產(chǎn)物生成。因此，可根據(jù)不同的RNAH備來修訂反轉(zhuǎn)錄條件，以滿足全長cDNA勺獲得。同時，通過RAC豉術(shù)獲得5端調(diào)控序列和多聚腺昔化信號序列的信息，有助于選擇引物以用于轉(zhuǎn)錄模型非常復雜的基因中擴增cDNA勺亞群。另外，RAC豉術(shù)能產(chǎn)生大量獨立克隆，這些克隆可用

11、來證實核昔酸序列，并使得被選擇性剪接或開始用于很少使用的啟動子的特殊轉(zhuǎn)錄物的分離成為可能。 RAC豉術(shù)從理論上來說是很簡單的，但是實際操作中會面臨許多技術(shù)上的難題。許多研究人員發(fā)現(xiàn)，利用RAC也獲得全長基因并非如想像中那般成功，甚至經(jīng)常會發(fā)生錯誤的擴增和克隆結(jié)果，多數(shù)情況下,5端的編碼區(qū)經(jīng)常會由于反轉(zhuǎn)錄過程的不徹底而丟掉，特別是由于有大的轉(zhuǎn)錄物或者存在復雜的二級結(jié)構(gòu)的時候，而且連接反應通常是特異性差效率很低，這樣PCR功進行就不能保證.尤其在長片段擴增時，PCR就顯得不那么有效.例如幾個Kb片段的產(chǎn)物就需要優(yōu)化改變擴增條件， 而且擴增結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)非特異性擴增條帶，使得選擇目的條 帶變得十分困難，而對于豐度較低，長度較長的基因RACEf法困又t更大，這是困擾研究人員的一大難題。由于RACET增中經(jīng)常出現(xiàn)由于引物的不匹配而導致的非特異性擴增，有時需要進行幾輪巢式擴增來達到獲得特異性擴增的目的，然而 多輪擴增又容易提高PCRK應的錯誤發(fā)生率，由于這些原因，利用RAC豉術(shù)通常不易獲得所希望的結(jié)果。 盡管RAC豉術(shù)在應用中取得了很大的成功.但在實際操作過程仍有不少局 限性。一般來說導致失敗