土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

1、課題課題2 2 土壤中分解尿素的細菌的土壤中分解尿素的細菌的分離分離與與計數(shù)計數(shù)尿素尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 2 重要的農(nóng)業(yè)氮肥。重要的農(nóng)業(yè)氮肥。只能被土壤中細菌分解為只能被土壤中細菌分解為NHNH3 3才能被植物吸才能被植物吸收利用收利用 CO(NH CO(NH2 2) )2 2 + H + H2 2O COO CO2 2 +2NH+2NH3 3細菌脲酶細菌脲酶一、課題背景一、課題背景二、研究思路二、研究思路 （一）篩選菌株（一）篩選菌株 提出的問題提出的問題 如何尋找如何尋找耐高溫耐高溫的酶？的酶？ 解決問題的思路解決問題的思路 尋找尋找耐高溫耐高溫環(huán)境；環(huán)境； 原理原理 高

2、溫淘汰其他菌，選出耐高溫細菌，高溫淘汰其他菌，選出耐高溫細菌， 耐高溫菌種提取耐高溫酶。耐高溫菌種提取耐高溫酶。（一）篩選菌株（一）篩選菌株KHKH2 2POPO4 4 1.4g 1.4g NaHPO NaHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO MgSO4 4 H H2 2O 0.2gO 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素 1.0g1.0g 瓊脂瓊脂 15.0g15.0g 將上述物質(zhì)溶解后，將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到用蒸餾水定容到1000mL1000mL。 該培養(yǎng)基的配方中，為該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？

3、源的分別是什么物質(zhì)？ 此配方能否篩選出產(chǎn)生此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細菌？為什么？脲酶的細菌？為什么？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素氮源：尿素能。只有產(chǎn)生脲酶的能。只有產(chǎn)生脲酶的細菌能利用尿素作為氮細菌能利用尿素作為氮源而生存。源而生存。（一）篩選菌株（一）篩選菌株1 1、選擇培養(yǎng)基：、選擇培養(yǎng)基： 允許特定種類的微生物生長，同時允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。基。2 2、菌株：、菌株： 純且活狀態(tài)所保存的菌種純且活狀態(tài)所保存的菌種 。（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目：（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目： 1 1、活菌計數(shù)法（、活菌計數(shù)法

4、（稀釋涂布平板稀釋涂布平板） （1 1）操作方法：）操作方法： 稀釋涂布平板稀釋涂布平板統(tǒng)計菌落數(shù)統(tǒng)計菌落數(shù) （2 2）原理：）原理： 1 1個菌落個菌落1 1個活菌個活菌 （3 3）統(tǒng)計原則）統(tǒng)計原則 選選 3030 300 300 個菌落的平板統(tǒng)計個菌落的平板統(tǒng)計 每個稀釋度取每個稀釋度取3 3個平板取個平板取其其平均值平均值為什么？ 例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同 一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為10106 6的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。 1 1、甲同學(xué)在該濃度下涂布

5、了一個平板，統(tǒng)計的、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為菌落數(shù)為230230。 2 2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A A、B B、C C三個平板，三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為2121、212212、256256，該同學(xué)以這三，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值個平板上菌落數(shù)的平均值163163作為統(tǒng)計結(jié)果。作為統(tǒng)計結(jié)果。 你認為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，你認為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？錯在哪？ 甲：沒有甲：沒有重復(fù)實驗重復(fù)實驗（至少涂布（至少涂布3 3個平板）個平板） 乙：乙：A A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值組

6、結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目 1 1、活菌計數(shù)法、活菌計數(shù)法 （4 4）統(tǒng)計結(jié)果：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實）統(tǒng)計結(jié)果：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目際數(shù)目低低，因此統(tǒng)計結(jié)果一般用，因此統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)菌落數(shù)表示。表示。 每克樣品中的菌株數(shù)每克樣品中的菌株數(shù)= =（C/V)C/V)* * M M C: C:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)； V: V:所用稀釋液的體積（所用稀釋液的體積（mLmL）；）；M:M:稀釋倍數(shù)。稀釋倍數(shù)。2 2、顯微鏡直接計數(shù)、顯微鏡直接計數(shù) 利用選擇培養(yǎng)基進行尿素分解菌的分離利用選擇

7、培養(yǎng)基進行尿素分解菌的分離過程中，從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為過程中，從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為10106 6的培養(yǎng)基中，的培養(yǎng)基中，A A、B B兩同學(xué)分別得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。兩同學(xué)分別得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。 1 1、A A同學(xué)篩選出同學(xué)篩選出150150個菌落。個菌落。 2 2、B B同學(xué)篩選出同學(xué)篩選出5050個菌落。個菌落。 B B認為認為A A的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細菌也能在該培養(yǎng)基中生長。素的細菌也能在該培養(yǎng)基中生長。A A確認自己確認自己的操作無誤，但也拿不出能令人信服的證據(jù)。的

8、操作無誤，但也拿不出能令人信服的證據(jù)。 請你幫助請你幫助A A同學(xué)改進實驗，提供具有說明同學(xué)改進實驗，提供具有說明了的證據(jù)。了的證據(jù)。 設(shè)置對照設(shè)置對照同等條件下，培養(yǎng)空白培養(yǎng)基同等條件下，培養(yǎng)空白培養(yǎng)基（三）設(shè)置對照（三）設(shè)置對照 1 1、設(shè)置對照的目的：、設(shè)置對照的目的： 排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。 對照實驗對照實驗是指除了是指除了 被測試被測試 的條件外，的條件外，其他條件都其他條件都 相同相同 的實驗。滿足該條件的實驗。滿足該條件的稱為的稱為 對照對照組，未滿足該條件的稱為組，未滿足該條件

9、的稱為 實驗實驗 組。組。四、實驗過程四、實驗過程 （一）土壤取樣（一）土壤取樣 1 1、天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基：、天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基： 2 2、土壤取樣：、土壤取樣： （1 1）取樣的位置：）取樣的位置： 土壤，天然培養(yǎng)基，含有大量的微生物，土壤，天然培養(yǎng)基，含有大量的微生物，其中其中7070 9090是細菌。在富含有機質(zhì)的土壤是細菌。在富含有機質(zhì)的土壤層的層的3 3 8cm8cm處中分布著絕大多數(shù)的細菌。處中分布著絕大多數(shù)的細菌。 （2 2）取樣要求：鏟去表層土。）取樣要求：鏟去表層土。 菌落計數(shù)菌落計數(shù)配制土壤溶配制土壤溶液液系列稀釋系列稀釋涂布平板與涂布平板與培養(yǎng)培養(yǎng)（二）樣品稀釋

10、（二）樣品稀釋 （1 1）測細菌數(shù)：一般用）測細菌數(shù)：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀釋液稀釋液 （2 2）測放線菌：一般用）測放線菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀釋液稀釋液 （3 3）測真菌數(shù)：一般用）測真菌數(shù)：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀釋液稀釋液原則：確保平板上的菌落數(shù)在原則：確保平板上的菌落數(shù)在3030 300300之間。之間。（三）微生物的培養(yǎng)與觀察（三）微生物的培養(yǎng)與觀察 1 1、接種：用適當(dāng)?shù)南♂屢鹤魍坎计桨?、接種：用適當(dāng)?shù)南♂屢鹤魍坎计桨?2 2、培養(yǎng)：細菌：、培養(yǎng)：細菌：3030 3737，1 1 2d

11、;2d; 放線菌放線菌:25:25 28, 528, 5 7d;7d; 霉菌霉菌: 25: 25 28, 328, 3 4d.4d. 3 3、觀察：、觀察：a.a.每每24h24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目統(tǒng)計一次菌落數(shù)目 b.b.以以“穩(wěn)定穩(wěn)定菌落菌落”為觀察對象為觀察對象 （四）鑒定：篩選后必鑒定（四）鑒定：篩選后必鑒定鑒別培養(yǎng)基：不影響微生物的鑒別培養(yǎng)基：不影響微生物的生存生存 酚紅培養(yǎng)基酚紅培養(yǎng)基： 鑒定分解尿素的細菌鑒定分解尿素的細菌。 原理：脲酶催化尿素分原理：脲酶催化尿素分解成氨解成氨培養(yǎng)基堿性增強培養(yǎng)基堿性增強 酚紅變紅酚紅變紅脲酶陽性脲酶陽性課本課本P26(1)作樣品系列稀釋液作樣品系列稀釋液 (2)用適當(dāng)?shù)南♂屢和坎计桨逵眠m當(dāng)?shù)南♂屢和坎计桨?在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、溫度及在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出相同而穩(wěn)定的菌落培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出相同而穩(wěn)定的菌落特征。特征。操作提示操作提示（一）無菌操作 1. 取土樣的小鐵鏟和盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。 2. 應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入燒