清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒黏附、膜融合影響的實驗研究

1、清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒黏附、膜融合影響的實驗研究                      作者：袁斌  廖輝 汪受傳 徐建亞 李華麗 李江全【摘要】  目的 研究清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒黏附、膜融合過程的抑制作用。方法 應(yīng)用溫度轉(zhuǎn)換的方法，在病毒黏附階段（溫度轉(zhuǎn)換前）和病毒侵入階段（溫度轉(zhuǎn)換后）分別加入清肺口服液含藥血清，監(jiān)測兩個階段

2、病毒抑制率和平均吸光度(A)值，觀察研究清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒黏附和膜融合的影響。結(jié)果 溫度轉(zhuǎn)換實驗前，含藥血清組平均A值與病毒對照組無顯著性差異；病毒侵入階段（溫度轉(zhuǎn)換后）的清肺口服液含藥血清組病毒抑制率為增多，平均A值明顯升高。溫度轉(zhuǎn)換實驗前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 清肺口服液含藥血清的抗病毒作用主要表現(xiàn)在呼吸道合胞病毒黏附后的膜融合及侵入階段。 【關(guān)鍵詞】  清肺口服液/血清學(xué)； 呼吸道合胞病毒/中醫(yī)藥療法； 清熱解毒劑； 實驗    【Abstract】  Objective  To study the inhib

3、ition effects of Qingfei oral liquid medicine?contained serum on adhesion and membrane fusion process of respiratory syncytial virus. Methods  Using the method of temperature conversion，we added Qingfei oral liquid medicine?contained serum during adhesion period(before temperature conversion) a

4、nd invasion period(after temperature conversion) respectively.Monitor virus inhibition rates and average A of the two periods，observe the influence of Qingfei oral liquid medicine?contained serum on adhesion and membrane fusion process of respiratory syncytial virus. Results  No significant dif

5、ferences were found on the average A between Qingfei oral liquid medicine?contained serum group and virus control group before temperature conversion experiment.After the temperature conversion，virus inhibition rates of Qingfei oral liquid medicine?contained serum group increased，the average A incre

6、asing obviously.Differences were significant before and after temperature conversion experiment. Conclusion  The antiviral effect of Qingfei oral liquid medicine?contained serum mainly embodies on the membrane fusion and invasion phases  after adhesion process of respiratory syncytial viru

7、s.    【Key words】  Qingfei oral liquid/Serology；  RSV/TCM therapy；  Heat?clearing and detoxifying agents;  Expertimental    呼吸道合胞病毒(Respiratory syncyntial virus，RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病毒病原1。是老年人和免疫抑制患者呼吸道疾病的重要病原2，西醫(yī)對其尚無理想治療措施。清肺口服液(由炙麻黃、苦杏仁、生石膏、黃芩、葶藶子、炙桑白

8、皮、前胡等組成)為江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，廣泛應(yīng)用于臨床治療小兒呼吸道合胞病毒肺炎，療效較好，前期相關(guān)研究也表明，清肺口服液含藥血清對RSV有抑制作用3，但這種抑制作用的具體環(huán)節(jié)尚未得以闡明。為此，本研究從病毒的微觀組織結(jié)構(gòu)和黏附侵入靶細(xì)胞階段過程的角度出發(fā)，設(shè)計進(jìn)行溫度轉(zhuǎn)換實驗研究?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。    1  材料與方法    1.1  材料  呼吸道合胞病毒A亞型（Long株，廣州博特生物工程有限責(zé)任公司)；Hep?2（人喉癌上皮細(xì)胞，布克生物技術(shù)有限公司)；DMEM（美國GIBCO公司）；新生

9、牛血清（杭州四季青公司）；0.25%胰酶（美國GIBCO公司）；MTT（美國AMRESCO公司）；DMSO(上海永華特種化學(xué)試劑廠)；酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。    1.2  Hep?2細(xì)胞  培養(yǎng)Hep?2細(xì)胞采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，35 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，生長狀態(tài)良好的細(xì)胞每23 d傳代，0.25%胰酶消化2 min，鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓時停止消化，每次分34瓶。所有實驗均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。    1.3  呼吸道合

10、胞病毒液制備及組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）的測定4  Hep?2細(xì)胞以1×108/L接種25 mL培養(yǎng)瓶，每瓶3 mL。將長成單層細(xì)胞的培養(yǎng)液倒掉，接種病毒液，吸附1.5 h。加入適量含2%小牛血清的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)35 d。待細(xì)胞80%產(chǎn)生病變后，置-80 （至少2 h）和37 反復(fù)凍融3次。離心管離心10 min，2 500 r/min。棄沉淀，收集病毒上清液，分裝后于-80 保存?zhèn)溆?。Hep?2細(xì)胞以1×108/L接種96孔培養(yǎng)板，每孔100 L。病毒液用維持液10倍系列稀釋8個濃度。細(xì)胞長成單層時吸棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液洗細(xì)胞面，接種各稀釋度的病毒

11、液，并設(shè)正常細(xì)胞對照組。置35 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中吸附2 h，15 min搖晃1次，使病毒均勻吸附。吸棄病毒液，每孔加維持液100 L，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察病變程度并記錄。以最高稀釋度不再出現(xiàn)新病變時為終點，用Reed?Muench公式計算病毒TCID50。    1.4  含藥血清和利巴韋林對細(xì)胞最大無毒濃度測定  Hep?2細(xì)胞以1×108/L加入96孔細(xì)胞板，每孔100 L，待長成單層后，加入維持液稀釋后的清肺口服液含藥血清，每孔100 L，并設(shè)正常細(xì)胞對照。置37 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培

12、養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變至72 h。棄去上清液，用移液器每孔加入MTT（1 g/L）100 L。置孵箱孵育4 h。吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 100 L，振蕩，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，用酶標(biāo)儀測定各孔平均吸光度(A)值，確定藥物的最大無毒濃度。百事通    1.5  溫度轉(zhuǎn)換實驗  Hep?2細(xì)胞以1×108/L分種于96孔板，100 L/孔，共種2板。待細(xì)胞生長至80%匯合，將板置4 30 min。其中一板吸棄培養(yǎng)液，加入TCID50 RSV，細(xì)胞對照加冷DMEM，50 L/孔。4 孵育2 h，每隔15 min搖晃1次

13、，使病毒均勻吸附。吸棄病毒液，2%維持液洗2遍。加入2%維持液稀釋的清肺口服液含藥血清（10 g/L），細(xì)胞對照加DMEM，100 L/孔，每組設(shè)8個復(fù)孔。置35 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱孵育1.5 h。吸棄上清，預(yù)熱的2%維持液洗2遍，加2%維持液150 L/孔，35 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變并記錄，待病毒對照出現(xiàn)典型病變時測定A值。另一板4 時將病毒和含藥血清同時加入，并設(shè)細(xì)胞對照。4 吸附2 h。吸棄藥物及其中的病毒，2%維持液洗2遍，加2%維持液150 L/孔。35 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變并記錄，待病毒對照出

14、現(xiàn)典型病變時測定A值。病毒抑制率=（實驗組平均A值-病毒對照組平均A值）/（細(xì)胞對照組平均A值-病毒對照組平均A值）×100%。    1.6  統(tǒng)計學(xué)處理  數(shù)據(jù)計量資料采用±s表示，兩組比較用t檢驗。    2  結(jié)果    2.1  含藥血清對Hep?2細(xì)胞最大無毒濃度  在Hep?2中，清肺口服液含藥血清的最大無毒濃度為10 g/L。    2.2  呼吸道合胞病毒RSV?Long株TCI

15、D50  在Hep?2中，RSV?Long株TCID50為10-4.625/50 L。    2.3  溫度轉(zhuǎn)換實驗結(jié)果  溫度轉(zhuǎn)化前病毒抑制率為150%，溫度轉(zhuǎn)化后為1 142%。見表1。表1  3組溫度轉(zhuǎn)換前后平均吸光度值的比較 注：與病毒對照組比較，aP0.05。    3  討論    RSV屬副黏病毒科肺炎病毒屬，是有包膜的非節(jié)段性單股負(fù)鏈RNA病毒。RSV病毒表面由融合蛋白(F)、黏附蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)3個跨膜蛋白組成，共同參與病毒

16、外膜與宿主細(xì)胞膜胞的融合以及細(xì)胞培養(yǎng)過程中合胞體的形成；F蛋白與病毒進(jìn)入細(xì)胞并形成特征性的合胞體有關(guān)，還具有促使RSV在感染細(xì)胞間傳播及溶血的作用5。有研究認(rèn)為F蛋白介導(dǎo)病毒與受染細(xì)胞間的膜融合作用，在病毒感染過程是必需的6。和其他病毒一樣，呼吸道病毒和宿主細(xì)胞的結(jié)合是病毒進(jìn)入感染靶細(xì)胞的前提條件。多數(shù)病毒在04 低溫下發(fā)生結(jié)合，而僅在接近生理溫度下才侵入細(xì)胞。這是因為與病毒黏附不同，有包膜的病毒的侵入是通過膜融合完成的，這一過程需要能量，而所需能量只有在生理溫度下才能得到供給。    本實驗在病毒黏附階段（溫度轉(zhuǎn)換前）加入清肺口服液含藥血清，檢測平均A值與病毒對

17、照組無顯著性差異；在病毒侵入階段（溫度轉(zhuǎn)換后）加入清肺口服液含藥血清，病毒抑制率為1 142%，平均A值明顯升高，靶細(xì)胞受到保護(hù)，提示該藥沒有直接影響病毒與靶細(xì)胞的黏附，其作用發(fā)揮主要在阻止病毒的膜融合及侵入。提示清肺口服液對呼吸道合胞病毒的作用位點可能是與此病理過程緊密相關(guān)的病毒表面F蛋白。清肺口服液可能在感染的早期運用療效更好?，F(xiàn)代病毒生物分子學(xué)的研究也提示，對F蛋白結(jié)構(gòu)的深入了解，可以提供研制相關(guān)病毒抑制藥物作用靶位點的線索，進(jìn)而可以阻礙F蛋白構(gòu)象的改變，防止其功能性結(jié)構(gòu)的形成，從而阻斷病毒與細(xì)胞的融合這一環(huán)節(jié)，達(dá)到抑制病毒增殖的目的?，F(xiàn)代藥理學(xué)實驗研究表明，中醫(yī)藥治療疾病的療效往往通過

18、多環(huán)節(jié)多靶點的共同作用實現(xiàn)，將從含藥血清對細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)改變影響的角度進(jìn)一步探討其共同作用機(jī)制。【參考文獻(xiàn)】  1 Hall CB.Respiratory syncytial virus：a continuing culprit and conundrumJ.J Pediatr，1999，135(2 Pt 2)：227.2 Falsey AR，Walsh EE.Relationship of serum antibody to risk of respiratory syncytial virus infection in elderly adultsJ.J Infect Dis，1998，177(2)：463?466.3 汪受傳