單克隆抗體的制備方法

1、一、單克隆抗體的概念和原理免疫反應(yīng)是人類對疾病具有抵 抗力的重要因素。當(dāng)動物體受抗原刺激后可產(chǎn)生抗體。抗體 的特異性取決于抗原分子的決定簇，各種抗原分子具有很多 抗原決定簇，因此，免疫動物所產(chǎn)生的抗體實(shí)為多種抗體的 混合物。用這種傳統(tǒng)方法制備抗體效率低、產(chǎn)量有限，且動 物抗體注入人體可產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。此外，要把這些不 同的抗體分開也極困難。近年，單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)，是 免疫學(xué)領(lǐng)域的重大突破。（1）單克隆抗體的基本概念抗體主要由 B 淋巴細(xì)胞合成。每個 B 淋巴細(xì)胞有合成一種抗體的遺傳基因。動物脾臟有上 百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，含遺傳基因不同的 B淋巴細(xì)胞 合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺

2、激時，抗原分子上的許多 決定簇分別激活各個具有不同基因的B 細(xì)胞。被激活的 B 細(xì)胞分裂增殖形成該細(xì)胞的子孫，即克隆由許多個被激活B細(xì)胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多種抗體。如果能選出一 個制造一種專一抗體的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng) 分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成一種 決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。（2）單克隆抗體技術(shù)的基本原理要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆 B 淋巴 1 細(xì)胞，但這種 B 淋巴細(xì)胞不能在體外生長。而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓 瘤細(xì)胞可在體外生長繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞 與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。 這種雜種細(xì)胞繼

3、承兩種親代細(xì)胞的特性，它既具有B 淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖 永存的特性，用這種來源于單個融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群， 可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。其制備原理示 意如下：二、基本方法 21. 抗原提純與動物免疫7 對抗原的要求是純度越高越好， 尤其是初次免疫所用的抗原。如為細(xì)胞抗原，可取1 X 10個細(xì)胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐劑并經(jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化 的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動 物免疫。選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的 BALB/c健康小鼠，鼠齡在812 周，雌雄不限。 為避免小鼠反應(yīng)而不佳或免疫過程中死

4、亡， 可同時免疫 34只小鼠。免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動物、抗 原形式、 免疫途徑不同而異， 以獲得高效價(jià)抗體為最終目的。 免疫間隔一般23周。一般被免疫動物的血清抗體效價(jià)越 高，融合后細(xì)胞產(chǎn)生高效價(jià)特異抗體的可能性越大，而且單 克隆抗體的質(zhì)量（如抗體的濃度和親和力）也與免疫過程中 小鼠血清抗體的效價(jià)和親和力密切相關(guān)。末次免疫后 34 天，分離脾細(xì)胞融合。2. 骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備選擇瘤細(xì)胞株的最重要 的一點(diǎn)是與待融合的 B 細(xì)胞同源。如待融合的是脾細(xì)胞，各 種骨髓瘤細(xì)胞株均可應(yīng)用，但應(yīng)用最多的是 SP2/0 細(xì)胞株。 該細(xì)胞株生長及融合效率均佳，此外，該細(xì)胞株本身不

5、分泌 任何5。融合細(xì)胞應(yīng)選擇15h10/ml X免疫球蛋白重鏈或輕鏈。 細(xì)胞的最高生長刻度為 91 0，倍增時間通常為 3 處于對數(shù)生長期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞（活性應(yīng)大于 95）。骨髓瘤細(xì)胞株在融合前應(yīng)先用含 8- 氮鳥 5，次日一般 即為對 10/ml 嘌呤的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，在細(xì)胞融合的前一 天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為 2X 數(shù)生長期細(xì)胞。 在體外培 養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長依賴適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因而，在培養(yǎng) 融合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時，還需加入其他飼養(yǎng)細(xì)胞 （feeder cell ）。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞，制備 方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后 的液體中即含

6、小鼠腹腔細(xì)胞，其中在巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞。亦有用小鼠的脾細(xì)胞、大鼠或豚鼠的腹腔細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的。 在制備飼養(yǎng)細(xì)胞時，切忌針頭刺破動物的消化器官，否則所 獲細(xì)胞會有嚴(yán)重污染。飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)至1X 5 /mlio，提前一天或當(dāng)天置板孔中培養(yǎng)。 細(xì)胞融合 3. 細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細(xì)胞 混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合。其后用培養(yǎng)液稀釋PEG消除PEG的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔 中培養(yǎng)。融合過程中有幾個問題應(yīng)特別注意。細(xì)胞比例： 骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可從 1:2 到 1:1o 不等，常用 1:4 的比例。應(yīng)保證兩種細(xì)胞在融合前都具有較高活性。反應(yīng) 時間：在

7、兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第 1min 滴加 4.5ml 4 培養(yǎng)液；間隔 2min 滴加 5ml 培養(yǎng)液，爾后加培養(yǎng)液 5oml。 培養(yǎng)液的成分：對融合細(xì)胞，良好的培養(yǎng)液尤其重要，其 中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴(yán)格配制。如融合 效率降低，應(yīng)隨時核查培養(yǎng)基情況。4.有限稀釋法篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細(xì)胞為HAT敏感細(xì)胞株，所以只有融合的細(xì)胞才能待續(xù)存活一周以上。融 合細(xì)胞呈克隆生長，經(jīng)有限稀釋后（一般稀釋至 o.8 個細(xì)胞 /孔），按 Poisson 法計(jì)算，應(yīng)有 36的孔為 1 個細(xì)胞 /孔。 細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋 0%20%孔底時，吸取培養(yǎng)上清用 ELISA 檢測抗體含量。首先依抗體

8、的分泌情況篩選出高抗體分泌孔， 將孔中細(xì)胞再行克隆化，爾后進(jìn)行抗原特異的 ELISA 測定， 選高分泌特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。單克隆抗體的制備和凍存 5.篩選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨 培養(yǎng)時間延長，發(fā)生污染、染色體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增 加?？贵w制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì) 胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊 的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的 濃縮和純化。 最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。 選用 BALB/c 小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注 5 射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接

9、種 一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集 510ml的腹 水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫 升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。5鼠，可根據(jù)腹 10/ 此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。接種細(xì)胞的數(shù)量 應(yīng)適當(dāng)，一般為5X水生長情況適當(dāng)增減。 選出的陽性細(xì)胞 株應(yīng)及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細(xì)胞株 活性僅有輕微的降低，而凍存在- 70 C冰箱則活性改變較快。 細(xì)胞不同于菌種， 凍存過程中需格外小心。 二甲基亞砜 （DMSO） 是普遍應(yīng)用的凍存保護(hù)劑。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活性多在 50 95之間。 如果低于 50，則說明凍存復(fù)蘇過程有問 題。6. 單克隆抗

10、體的純化 單克隆抗體的純化方法同多克隆抗 體的純化，腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體 高，純化效果好。 按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。 一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目 的，也有采用較簡單的酸沉淀方法。目前最有效的單克隆抗 體純化方法為親和純化法，多用葡萄球菌A 蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體(最常用 Sepharose )交聯(lián)，制備親和層析 柱將抗體結(jié)合后洗脫， 回收率可達(dá) 90以上。蛋白可與 IgG1 、 lgG2a、lgG2b和lgG3結(jié)合，同時還結(jié)合少量的IgM。洗脫液中的 6抗體濃度可用紫外光吸收法粗測，小鼠 lgG 單克隆抗體溶液 在A280nm

11、時，1.44 (吸光單位)相當(dāng)于 1mg/ml。經(jīng)低pH洗 脫后在收集管內(nèi)預(yù)置中和液或速加中和液對保持純化抗體 的活性至關(guān)重要。三、操作流程(一)脾細(xì)胞1 材料(1) 免疫過的血清抗體滴度高的 BALB/c 小鼠(2) 1640 培養(yǎng)液(3) 2.5 FCS 1 640 營養(yǎng)液2操作方法(1) 拉頸或用C02處死小白鼠。(2) 將小鼠放于 70酒精中浸泡消毒， 取出固定于板上， 在 無菌條件下取脾。(3) 把脾放入5ml含有2.5 % FCS的1640液中，冰浴下輕輕 洗去脾上的紅血球。7(4) 用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液 移入小試管中。(5) 直立小試管3min，使大塊

12、的結(jié)締組織下沉，把細(xì)胞懸液 移入離心管中。以 2.5 %FCS1640 充滿離心管，并以 400g 離心7min10min (與此同時應(yīng)開始制備骨髓瘤細(xì)胞) 。的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。 (7) 把沉淀用約 10ml 重復(fù)、 步驟。 (9) 計(jì)算細(xì)胞，以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于 80%為合格。(二)骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球 蛋白，這樣的瘤細(xì)胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的 滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì) 胞。選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：該瘤細(xì)胞系的來源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生

13、Y球蛋白或不分泌 到細(xì)胞外； 6 個細(xì)胞最好骨髓瘤細(xì)胞生長需要一個較高的細(xì) 胞密度 ,10/ml ； 8 生長速度快，繁殖時間短。目前常用的BALB/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：S194/5XXOBU1;SP2/0Ag14（簡稱 SP20）;P2 X? Ag8 6 5 3 （簡稱 653）； F0以 653 最為常用，它是由礦物油 4甲基 15 烷（ Pristane ， 降植烷）誘發(fā)出來的一種漿細(xì)胞瘤（ MinerolOil plasmacytoma， MOPC并經(jīng)過培育形成一株 8-氮鳥嘌呤 有抵抗力的亞系。骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入，保存于 -195 C液氮罐 中，試驗(yàn)時復(fù)蘇、增殖

14、、傳代即可。由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要胰 酶處理。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象， 在融合前， 77）的骨髓 20h15hx 10對數(shù)生長期（即培養(yǎng)6115可將培養(yǎng)基內(nèi)加入卩g/ml 8 氮鳥嘌呤。取約X 101640液再懸浮并計(jì)數(shù)。一，沉淀 以瘤細(xì)胞，在室溫離心（ 400g） 10min2.5 FCS （三）飼養(yǎng) 細(xì)胞在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生 存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長繁殖，加入 的細(xì)胞稱之為飼養(yǎng)細(xì)胞（ Feeder cell ）。在細(xì)胞融合和單克 隆的選擇過程中，就是在少量的或單個細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生 長繁殖成群體，因此在這一過程中必須使

15、用飼養(yǎng)細(xì)胞。許多 種類的動物細(xì)胞都 9可以做飼養(yǎng)細(xì)胞，如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì) 胞等，常選用腹腔滲出細(xì)胞，其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞，另一 方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞 的生長造成良好的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的來源可以是與骨髓瘤細(xì) 胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠，如 C57 鼠，昆明小白 鼠等。1材料（1）小鼠（ BALB/c 或 C57 小白鼠）若干只。（2）11.6 蔗糖溶液（經(jīng) 10 磅 30min 高壓滅菌）。2操作方法（1）拉頸處死小鼠。（2）70酒精浸泡消毒 10min 。（3）用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開一小口

16、，剝開皮膚，露出腹 腔。（4）用注射器將 4ml 11.6 蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕 揉 1min 仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。10（5）1 000r min 離心 10min 。（6）取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液。臺盼藍(lán) 染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，使每毫升含 40 萬個活細(xì)胞。（ 7）以 1ml 吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)皿，每孔 0.05ml ，含2萬個細(xì)胞，放入 C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即可供細(xì)胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少，則可以在細(xì)胞換液時再加入一些（四）融合細(xì)胞融合劑 1.細(xì)胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學(xué)融合 法和生物融合法，如仙臺

17、病毒，此處例舉化學(xué)融合法中的一 種即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG,在分子量為200700時，呈無色、無臭 的粘稠狀液體，分子量大于 1 000 時，呈乳白色蠟狀固體， 能溶于水、乙醇及其他許多有機(jī)溶劑，對熱穩(wěn)定，與許多化 學(xué)藥品不起作用。用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子 量為 4 000 者，常用濃度為 50， pH8.0pH8.2 （用 10 NaHC酮整），3分子量小的PEG融合效應(yīng)差，又有毒性，分 子量過大，則粘性太大，不易操作。50%濃度，pH偏堿時融合效應(yīng)最高。11也有采用30%50%濃度的PEG加上10%二甲亞砜。不同批號的PEG即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異， 選用

18、時必須注意。每批都必須進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)后方可應(yīng)用。 要買高純度的，一般選供氣相色譜用的PEG。2. 融合過程融合的方法很多，常用的有轉(zhuǎn)動法和離心法。 融合時脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例為 1:1 至 10:1 不等。 3:1 或 5:1 最為常用。試劑與材料 1> 供融合用的脾細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞。 (1)。(2) 1640 培養(yǎng)液 100ml 100ml 液。(3) 完全 1640 。液 164050ml (4) 2.5FCS 。培養(yǎng)液 100ml(5) HAT 瓶中高壓 滅菌，使用前用預(yù) 25mlPEG10gServa000:取分子量 50PEG4 , 高純度的(日本進(jìn)口或)放入 12熱于4

19、0C的1640液10ml等量(W/V)混合，以酚紅檢查pH, 一般不必調(diào)pH。如pH有改變，可用HCI或NaHC酮整。3(7) 10ml 和 50ml 的滅菌沉淀管或瓶?？姿芰吓囵B(yǎng)盤。 40.操作方法2> 準(zhǔn)備好脾細(xì)胞。87液。1640% FCS-沉淀 管中混合 50ml10 脾細(xì)胞和 10 小鼠骨髓瘤細(xì)胞， 并加入 50ml 2.5 在 室溫400g離心3min，使細(xì)胞沉淀。移去上清液。 輕敲管底部，使沉淀流動，把沉淀管放于40 C水浴中，使其達(dá)融合溫度。 加預(yù)熱至40 C的50 % PEG0.8ml，用1ml吸管緩慢滴加， 邊加邊搖沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現(xiàn)，滴加過程要求 持續(xù)

20、2min 。13 加 1ml1640 液，邊加邊搖動，持續(xù) 1min。重復(fù)一次。 加1ml 1640液，邊加邊搖動，持續(xù)0.5min 。重復(fù)一次。(11)力口 1640液15ml。(12)室溫，400g離心1min，使細(xì)胞沉 淀。(13)去上清，輕敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。 圍 往已于前一日種有飼養(yǎng)細(xì)胞的 40孔塑料培養(yǎng)盤中滴加融 合的細(xì)胞液，每孔 1 滴(約 0.05ml )。(15) 輕搖后，放入5%CO2飽和濕度的37C溫箱中培育。(16) 第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養(yǎng)液。注意 輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細(xì)胞吸出，根據(jù)需要加 入適量的飼養(yǎng)

21、細(xì)胞。(17) 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培養(yǎng)液。在每 次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在 10 天左右就可觀察到 雜交瘤細(xì)胞生長出來。 大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞在 1020 天內(nèi)出現(xiàn)， 但也有在 1 個月左右才能出現(xiàn)的。 14 雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)后，吸取上清液，檢查抗體。(18) 對繼續(xù)生長的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖傳代。在傳代過程中， 依情況取消 HAT液和完全1640液而代之以10 uS- 1640液 同時保存于液氮和進(jìn)行克隆化，在這期間每代都要檢查抗體， 以防止產(chǎn)生抗體細(xì)胞的變異和丟失。細(xì)胞融合的關(guān)鍵 3.1技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。 例如，供者淋巴細(xì)胞沒有查到免疫應(yīng)答。這必然要失

22、敗的。 2融合試驗(yàn)最大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個干凈的環(huán)境，以及適宜的無菌操作技術(shù)四、雜交瘤細(xì)胞的保存(一)保存當(dāng)獲得產(chǎn)生所需的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞后， 必須將一部分雜交瘤細(xì)胞保存，否則在連續(xù)傳代的過程中，15可能產(chǎn)生突變或染色體的漂移以至喪失固有特性或丟失產(chǎn) 生抗體的特性。另外在長期的培養(yǎng)過程中，難免不發(fā)生污染 以至于毀滅。所以必須冷藏保存一部分。保存方法如下：材料 1(1) 細(xì)胞：取對數(shù)生長期的細(xì)胞。(2) 10 二甲基亞砜保護(hù)液(二甲基亞砜能損壞濾器，而又 被高壓所破壞， 所以不能過濾或高壓消毒。 其本身就是毒品， 無菌)：含 10二甲基亞砜、 20滅活胎牛血清， 70

23、 RPMI 1640 液。100卩g/ml1640 % FCS-培養(yǎng)液：含青霉素 100U/ml，鏈霉 素(3) 20 2ml 安瓶等 (4) 滅菌的 操作方法 2(1) 去掉細(xì) 胞培養(yǎng)瓶中的舊的培養(yǎng)液，加入10%FCS-1640 液，使細(xì)胞懸浮。7(2) 1 000r/min 離心10min，去上清。細(xì)胞沉淀用 10%二甲基亞砜保護(hù)液制成懸液，使成1.0 x 10細(xì)胞/ ml。(3) 取樣，臺盼蘭染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，應(yīng)在95%以上。16(4) 用注射器將細(xì)胞分裝安瓶，每瓶0.5ml1.0ml ,熔封安瓶。(5) 放 4C 2h 。放液氮罐氣態(tài)部分（-70 C） 15h。（7） 轉(zhuǎn)入液氮部分。二

24、）復(fù)蘇1.從液氮罐中取出安瓶立即放37 C水浴中速溶。2.無菌操作打開安瓶，取出細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入組織培養(yǎng)瓶。3.逐滴緩慢加入20% FCS- 1640培養(yǎng)液3.5ml ,這個過程延 續(xù) 3min 。C培養(yǎng)。CO%飽和濕度，374. 5培養(yǎng)液。20% FCS1640后棄去培養(yǎng)液上清，加入新鮮的. 54h 6.繼續(xù)培養(yǎng)，換液，以至形成單層。動物的選擇與免疫 171 .動物的選擇 純種 BALB/C 小鼠，較溫順，離窩的活動范 圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能 飼養(yǎng)成活。 目前開展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種 BALB/C小鼠。2.免疫方案 選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成

25、功，獲得高質(zhì)量的 McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的 特性不同而定。1 ）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng) 先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏 不完全佐劑。初次免疫 抗原150卩g加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.81ml,0.2ml/點(diǎn)）J 3周后第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或 ip （腹腔 內(nèi)注射）（ ip 劑量不宜超過 0.5ml ）J 3周后第三次免疫 劑量同一，不加佐劑， ip （57 天后采血測其 效價(jià)）J 23周18加強(qiáng)免疫，劑量 50500卩g為宜，ip或iv （靜

26、脈內(nèi)注射） 3天后J取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：將可溶性抗原 顆粒化或固相化，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面 可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可 直接采用脾內(nèi)注射。使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的 免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對抗原的反應(yīng)性。（ 2）顆粒抗原免疫性強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效 果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為 7 10 個細(xì)胞。x 1 27 初次免疫 1 x 10/0.5ml ip周后3；27第二次免疫1 x 10/0.5ml ipJ 3周后197 iv x 10/0.5ml ip 或(融合前三天

27、)加強(qiáng)免疫1 J取脾融合細(xì)胞融合細(xì)胞融合前準(zhǔn)備 1)骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動物屬于同一 品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜 1 ( 。常用的骨 髓瘤細(xì)胞系見表 2-4McAb 交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大 量 2-4 用于融合試驗(yàn)的主要骨髓瘤細(xì)胞系表 Ig 鏈 名稱來源耐受藥物H LP3/X63-Ag8(X63) BALB/C骨髓瘤 MOPC-218-氮鳥嘌呤 r1 K20 P3/X63-Ag8 P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653) 8- 氮鳥 嘌呤 8- 氮鳥嘌呤 P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag8(不分泌型) K 脾細(xì)胞) B

28、ALB/CX63x( P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)8- 氮鳥嘌呤 雜交瘤脾細(xì)胞) BALB/CX63x( SP2/0-Ag14(SP2/0) 8- 氮鳥嘌呤 雜交瘤 BALB/C 骨髓瘤 8-氮鳥嘌呤 F0S194/5.XXO.BU.1 P3/X63-Ag8-5-溴脫氧尿嘧啶核苷-MPC11-45.6TG1.7 6-MPC-11 巰鳥嘌呤BALB/C骨髓瘤r2b K21O.RCY3.Ag1.2.38-大鼠骨髓瘤 LOUK - R210氮鳥嘌呤人骨髓瘤Kr1 GM15006TG-A12GM1500巰鳥嘌呤6- 21入& U-266AR 人骨髓瘤 U-266 8-氮鳥嘌 呤，20

29、%、牛血清的濃度一般在 10%如RPMI1640 DMEM培 養(yǎng)基。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，65431:可按105X /ml為宜，最大濃度不得超過10/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長的中期時，10細(xì)胞濃度以氮天傳代一次。 細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8- 的比例傳代。每1: 1035呈均一的敏感性。HAT鳥嘌呤進(jìn) 行處理，使生存的細(xì)胞對）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個 或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可 促進(jìn)這2 （的過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì) McAb些細(xì)胞生 長繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備胞， 如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培

30、養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng) 細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：經(jīng)放射線照3T3小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。 也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系 54細(xì)胞/孔。10射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為 2X或10 .細(xì)胞融合的步驟2 1） 制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。（10周小 鼠，與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用 BALB/C6 J 22 拉頸處死，浸泡在 75%酒精內(nèi)， 3 5min用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無菌注射器注入 56ml 預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）J反復(fù)沖洗，吸出沖洗液J6min分離10ml離心管，1200rpm/5沖洗液放入 J 5 /mllOFC

31、S小牛血清（NCS或胎 牛血清（）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1X 20%用 J1/10096 加入孔板，孔23放入37 C CO2孵箱培養(yǎng)（2）制備免疫脾細(xì)胞 最后一次加強(qiáng)免疫 3 天后小鼠拉頸處死J無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次J脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)J 2離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗次 J計(jì)數(shù)J 248 脾淋巴細(xì)胞懸液備用取 10（3）制備骨髓瘤細(xì)胞取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心J用無血清培養(yǎng)液洗2次J7細(xì)胞備用101 X計(jì)數(shù)，取得）融合（4 將骨髓瘤細(xì)胞 與脾細(xì)胞按 1： 10 或 1： 5 的比例混合在一起，在 50ml 離心 管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗 1 次，離心， 1200rpm,8min;棄上清，

32、用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動。 90s內(nèi)加入37C預(yù)溫的1ml45%PEG（分子量4000）溶 液，邊加邊輕微搖動。37 C水浴作用90s。 加37oC預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止 PEG乍用，每隔2min分別加入 1ml、2ml、3ml、4ml、5ml 和 256mlo 離心， 800rpm, 6min o 充上清，用含20%、牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。 將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100卩l(xiāng)。一般一個免疫脾臟可接種 4塊96孔板。 將培養(yǎng)板置 37C、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測 1 . HAT

33、選擇雜交瘤細(xì)胞 脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng) PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體， 只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃 嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具 有上述兩種酶，在 HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。在用HAT選擇培養(yǎng)12天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，34 天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成、集落， 26HAT選擇培養(yǎng)液維持710天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布 滿孔底 1/10 面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所 需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每23天

34、換一半培養(yǎng)液?？贵w的檢測 2 檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、 抗 體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、 特異、敏感的方法為原則。常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性 抗原、細(xì)胞 McAb的檢測。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗(yàn)適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等。雜交瘤的克隆化 雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn) 行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過 HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個 孔內(nèi)只有一個克隆。在實(shí)際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多 的克

35、隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、所需要 的抗體（特異性抗體） 分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。 要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要 27 克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡 早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞 所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞 生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即 使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交 瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力?？寺』姆椒ê芏?，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。有限稀釋法克隆 1 天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合） 。 1 （）克隆前 1 2 ）

36、將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹 干，計(jì)數(shù)。（。個細(xì)胞10/ml （3）調(diào)整細(xì)胞為337C、孵 箱中1001。孵育于。5%CO2（4 ）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞 層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞天換液，以后每 5）在第 72 31 次。天換液（ 細(xì)胞克隆形 成，及時檢測抗體活性。天可見） （ 68924 ）將陽性孔的細(xì)胞移至（ 7孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。 28（ 8）每個克隆應(yīng)盡快凍存。2 .軟瓊脂培養(yǎng)法克?。?）軟瓊脂的配制：含有20%NCS小 牛血清）的 2 倍濃縮的 RPMI1640。C預(yù)熱。1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，420.5%瓊脂：由1 份 1%瓊脂加 1 份含 20%小牛血清的 2 倍濃縮

37、的 RPMI1 640配 制而成。置42 C保溫。（2）用上述 0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml 傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。3）按 100/ml ， 500/ml 或 5000/ml 等濃度配制需克隆的細(xì) 胞懸液。(4) 1ml 0.5%瓊脂液(42C預(yù)熱)在室溫中分別與 1ml不 同濃度的細(xì)胞懸液相混合。(5 )混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37C、5%CO孵箱中。(6) 45天 后即可見針尖大小白色克隆，710天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的 24 孔中進(jìn)行培養(yǎng)。( 7)檢測抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。29雜交瘤細(xì)

38、胞的凍存與復(fù)蘇1 雜交瘤細(xì)胞的凍存 及時凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì) 胞是十分重要的。因?yàn)樵跊]有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞 系的時候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分 泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則可因 上述意外而前功盡棄。雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含 1 X 106以上，但對原始孔的雜交 瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變， 在 24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)， 當(dāng)長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。細(xì)胞凍存液： 50%小牛血清； 40%不完全培養(yǎng)液； 10%DMSO (二甲基亞砜) 。凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0C后放入-70 C超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì) 胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或