甘舒對(duì)抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷

1、甘舒對(duì)抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的研究中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室：馮鑒強(qiáng)教授等中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)生理教研室：潘實(shí)清教授 林明棟教授 周家國(guó)老師 劉玉潔老師 中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)室：譚炳炎老師 鄭琳老師實(shí)驗(yàn)結(jié)論：在一定濃度范圍內(nèi)，中藥保健品甘舒膠囊呈濃度依賴性的對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷（可明顯減小肝細(xì)胞凋亡率和增加存活率，修復(fù)損傷的肝細(xì)胞，改善肝細(xì)胞的功能）。1 實(shí)驗(yàn)材料1.1 細(xì)胞株正常肝細(xì)胞株LO2購(gòu)于上海，培養(yǎng)于10的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37，5%CO2條件下培養(yǎng)。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入藥物處理。1.2 主要試劑試劑名稱 供貨公司30% H2O2 Alfa Aes

2、arThiazolyl blue (MTT) SigmaPropidium iodide(PI) SigmaRPMI-1640 medium GibcoBRL Fetal bovine serum HycloneTrypsin 1：250 MBCHEM其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3 主要材料材料名稱 供貨公司0.22 m 微孔濾膜 Millipore96孔板 Corning24孔板 Corning25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶 Corning冷凍凍存管 Corning15 ml塑料刻度離心管 Corning50 ml塑料刻度離心管 Corning針筒式微孔濾膜過(guò)濾 Corning其他實(shí)驗(yàn)材料為國(guó)產(chǎn)材料1

3、.4 主要儀器儀器名稱 生產(chǎn)公司CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 Thermo Forma公司（美國(guó)）倒置相差顯微鏡 XDS-1B, Olympus公司（日本）SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；-80超低溫冰箱 Thermo Forma公司（美國(guó)）渦旋振蕩器 QL-901（江蘇）酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 流式細(xì)胞儀 BECKMAN-COULTER公司（美國(guó)）2. 實(shí)驗(yàn)方法2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5104 /孔接種于96孔板，200 l/孔，在37，5CO2培養(yǎng)條件下過(guò)夜后，按分組要求給以不同的處理因素，每組8個(gè)平行孔，處理時(shí)間終止時(shí)每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20 l，

4、37，繼續(xù)孵育4-h，終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清夜，每孔加入150 l DMSO，震蕩10-min，使藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜(Formazan)充分溶解，選擇570 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔的吸收值。按公式：存活率實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組100，求出實(shí)驗(yàn)組的存活率。重復(fù)5次。2.2 PI染色流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡各實(shí)驗(yàn)組按實(shí)驗(yàn)要求處理后，用2.5g/L的胰蛋白酶消化貼壁的肝細(xì)胞LO2，1000r/min離心10-min，棄去上清，PBS洗2遍，沉淀中加入預(yù)冷的70的乙醇4固定過(guò)夜，1 000r/min離心10 min，去上清，取106已固定的細(xì)胞，用PBS洗兩遍，去上清后加入300

5、 l DNA染液(內(nèi)含PI 100 g/ml和RnaseA 20單位/ml)，室溫避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率(激發(fā)波長(zhǎng)：488 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：610 nm)。測(cè)定數(shù)據(jù)按流式細(xì)胞儀所配制的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以DNA組方圖出現(xiàn)低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細(xì)胞的多少。2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（S）表示,組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)，有顯著意義后用最小有意義差異檢驗(yàn)（least significant difference, LSD）進(jìn)行均數(shù)間的多重比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)

6、果1 藍(lán)韻牌甘舒對(duì)抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性作用1.1不同濃度的H2O2作用于OL2細(xì)胞12 h對(duì)細(xì)胞存活率的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1106/瓶接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，在37，5CO2培養(yǎng)條件下過(guò)夜后，分別給以0 mol/L，50 mol/L，100 mol/L，200 mol/L，300 mol/L，400 mol/L，500 mol/L，600 mol/L，800 mol/L的H2O2作用LO2細(xì)胞12 h，觀察不同濃度的H2O2作用LO2細(xì)胞12 h對(duì)其存活率的影響，各組的細(xì)胞存活率如下表：表2.1 不同濃度的H2O2作用于LO2細(xì)胞12-h（MTT）濃度(mol/L)0501002

7、00300400500600800存活率()100.007.64100.238.15100.6812.0075.34 12.5861.34 7.6530.87 10.7629.218.1526.60 4.9917.53 5.36Fig.1不同濃度的H2O2作用于LO2細(xì)胞12-h*p0.01, vs control1.2 不同濃度的甘舒作用于OL2細(xì)胞12 h對(duì)細(xì)胞存活率的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1106/瓶接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，在37，5CO2培養(yǎng)條件下過(guò)夜后，分別給以0 g/ml，5 g/ml，10 g/ml，50 g/ml，100 g/ml，500 g/ml，1 mg/ml，5 mg

8、/ml，10 mg/ml，50 mg/ml的甘舒作用于OL2細(xì)胞24 h，觀察細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率分別為(100.005.24)%、(100.886.35)%、(100.578.21)%、(102.324.51)%、(100.495.63)%、(103.875.23)%、(98.517.22)%、(35.149.27)%、(29.876.31)%、(20.147.27)%，與對(duì)照組(0 g/ml甘舒)比較，5 mg/ml，10 mg/ml，50 mg/ml的甘舒所致的細(xì)胞存活率顯著的下降，并在此范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，H2O2對(duì)PC12細(xì)胞存活率的抑制作用逐漸增大。表1.2 不同濃度的甘舒作

9、用于OL2細(xì)胞12-h（MTT）濃度0 g/ml 5 g/m10 g/ml50 g/ml100 g/ml500 g/ml1 mg/ml5 mg/ml10 mg/ml50 mg/ml存活率()100.005.24100.886.35100.578.21102.324.51100.495.63103.875.2398.517.2235.149.2729.876.3120.147.27Fig. 2 不同濃度的甘舒作用于OL2細(xì)胞12 h*p0.01, vs control1.3 不同濃度的甘舒預(yù)處理LO2細(xì)胞24 h后對(duì)H2O2損傷的LO2細(xì)胞存活率的影響實(shí)驗(yàn)按給藥方法分為(1) 空白對(duì)照組(con

10、trol)，在細(xì)胞培養(yǎng)體系中不加入任何藥物，用無(wú)血清培養(yǎng)基正常培養(yǎng)細(xì)胞36 h；(2) 預(yù)處理組(preconditioning，PC)：用1 g/ml，5 g/ml，10 g/ml，50 g/ml，100 g/ml，500 g/ml，1 mg/ml，5 mg/ml，10 mg/ml的甘舒作用OL2細(xì)胞24 h，棄去上清夜，加入含無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞12 h ；(3) 損傷組(H2O2)：用無(wú)血清培養(yǎng)基作用OL2細(xì)胞24 h后換液，加入含不同濃度的H2O2無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞12 h；(4)預(yù)處理?yè)p傷組(PCH2O2)：用無(wú)血清培養(yǎng)基作用OL2細(xì)胞24 h后，棄去上清液，加入含不同濃度的H2O

11、2無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞12 h。預(yù)處理組(preconditioning，PC)和損傷組(H2O2)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如1.1和1.2，預(yù)處理?yè)p傷組(PCH2O2)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表表1.3 甘舒預(yù)處理對(duì)H2O2損傷的OL2細(xì)胞的影響（MTT） 損傷()甘舒濃度 300 mol/L400 mol/L500 mol/L600 mol/L0 g/ml61.647.9254.691.7637.008.1426.614.991 g/ml60.586.8458.175.4238.563.1627.022.445 g/ml58.816.8862.737.2836.133.9332.215.0210 g/ml74.8

12、77.9769.559.7937.963.4835.876.4150 g/ml86.259.0084.796.3938.426.4645.023.15100 g/ml101.315.14104.584.4948.546.5144.655.72500 g/ml102.8810.48103.212.4866.219.5759.535.671 mg/ml91.569.40107.047.6359.028.1652.118.215 mg/ml28.962.6735.902.3142.872.3538.153.5810 mg/ml31.802.8830.971.0940.053.0233.562.17F

13、ig. 3不同濃度的甘舒預(yù)處理LO2細(xì)胞24 h后對(duì)300 M H2O2損傷的LO2細(xì)胞存活率的影響*p0.01, vs control，#P0.01, vs H2O2 groupFig. 4不同濃度的甘舒預(yù)處理LO2細(xì)胞24 h后對(duì)400 M H2O2損傷的LO2細(xì)胞存活率的影響*p0.01, vs control，#P0.01, vs H2O2 groupFig. 5不同濃度的甘舒預(yù)處理LO2細(xì)胞24 h后對(duì)500 M H2O2損傷的LO2細(xì)胞存活率的影響*p0.01, vs control，#P0.01, vs H2O2 groupFig. 6不同濃度的甘舒預(yù)處理LO2細(xì)胞24 h后對(duì)6

14、00 M H2O2損傷的LO2細(xì)胞存活率的影響*p0.01, vs control，#P0.01, vs H2O2 group2 甘舒對(duì)抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡2.1不同濃度H2O2對(duì)OL2細(xì)胞凋亡的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1106/瓶接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，在37，5%CO2培養(yǎng)條件下過(guò)夜后，分別給以0 mol/L，100 mol/L，200 mol/L，300 mol/L，400 mol/L，500 mol/L，600 mol/L，800 mol/L，的H2O2作用LO2細(xì)胞12 h，觀察不同濃度的H2O2誘導(dǎo)LO2細(xì)胞凋亡的作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果如下表，提示H2O2可誘導(dǎo)LO2細(xì)

15、胞凋亡，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系的趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)選擇300 mol/L H2O2，400 mol/L H2O2，500 mol/L H2O2作為損傷LO2細(xì)胞的損傷濃度。表2.1 不同濃度的H2O2作用于LO2細(xì)胞12-h（FCM）濃度(mol/L)050100200300400500600800凋亡率()3.241.6142.971.153.522.0321.332.6759.633.2667.276.3272.214.5283.244.6785.395.542.2不同濃度的甘舒預(yù)處理LO2細(xì)胞24 h后對(duì)H2O2誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)按給藥方法分為：(1) 空白對(duì)照組(control)，在

16、細(xì)胞培養(yǎng)體系中不加入任何藥物，用無(wú)血清培養(yǎng)基正常培養(yǎng)細(xì)胞36 h；(2) 預(yù)處理組(preconditioning，PC)：用100 g/ml，500 g/ml，1 mg/ml的甘舒作用OL2細(xì)胞24 h，棄去上清夜，加入含無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞12 h ；(3) 損傷組(H2O2)：用無(wú)血清培養(yǎng)基作用OL2細(xì)胞24 h后換液，加入含不同濃度的H2O2無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞12 h；(4)預(yù)處理?yè)p傷組(PCH2O2)：用無(wú)血清培養(yǎng)基作用OL2細(xì)胞24 h后，棄去上清液，加入含不同濃度的H2O2無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞12 h。表2.2 甘舒預(yù)處理對(duì)H2O2誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞凋亡的影響（FCM）組別 損傷

17、300 mol/L（）400 mol/L（）500 mol/L（）Control3.540.513.601.243.282.37PC12.961.253.441.983.200.54PC23.152.233.261.573.573.51PC33.552.103.570.973.662.04H2O261.253.2768.334.5573.933.71PC1+ H2O246.583.8450.636.7956.673.55PC2+ H2O239.584.8642.703.9947.354.21PC3+H2O242.153.3651.236.5154.543.99Fig. 7 不同濃度的甘舒預(yù)處理對(duì)300 M H2O2誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞凋亡的影響*p0.01, vs controlFig