缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及一氧化氮的保護(hù)作用

1、    缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及一氧化氮的保護(hù)作用        摘要：目的研究缺氧在新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用及一氧化氮(NO)的保護(hù)作用。方法取 體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞置950 mL/L N2， 50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)16， 32和 48 h， 造成缺氧損傷的細(xì)胞模型，觀察凋亡發(fā)生的情況；將 NO供 體 SNAP加入培養(yǎng)基中，使其終濃度為100 mol/L， 置于上述缺氧環(huán)境中培養(yǎng)16，32和48h，檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 結(jié)果在缺氧條件下培養(yǎng)16， 32， 48

2、 h后 ， 心肌細(xì)胞的凋亡率分別為：(2.9± 0.5) ， (6.2± 0.8) 和 (26.6± 3.0) ;而加入NO供體后，凋亡率分別為：(0.2± 0.3) ， (3.4± 0.4) 和 (11.8± 1.2) 。 結(jié)論凋亡是心肌細(xì)胞缺氧損傷的主要形式；NO對(duì)缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：缺氧；凋亡； 一氧化氮；心肌細(xì)胞中號(hào) ：R364.4 R392.12文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：10078738(2000)03022503Hypoxia-induced apoptosis of cardiomyocyte an

3、d the protection of nitric oxideZHANG Feng12, LUO Xiao? xing1, ZHAO De? hua1（Department of Pharmacology,Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032, Shaanxi Province， China）CAO Yun-xin（Central laboratory,Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032, Shaanxi Province， China）Abstrac

4、t： Aim To study the role of hypoxia? induced apoptosis in neonatal rat cardiomyocyte and the protection effect of nitric oxide(NO). Methods Neonatal rat cardiomyocytes were cultured in an incubator of 950 mL/L N2 and 50 mL/L CO2 for 16， 32 and 48 h to create cell models of hypoxia injury and detect

5、apoptosis. And NO donor SNAP at 100 mol/L was added to the models. Apoptosis was detected in the hypoxia cells without or with No treatment. Results After hypoxia of 16， 32 and 48 h,the apoptosis rates of cardiomyocytes were 2.9 ± 0.5 ， 6.2 ± 0.8 and 26.6 ± 3.0 ， respectively. Whereas

6、 the apoptosis rates of cells treated with SNAP were 0.2 ± 0.3 ， 3.4 ± 0.4 and 11.8 ± 1.2 , respectively. Conclusion Apoptosis is the main form of hypoxia injury in cardiomyocytes; NO protect cardiomyocytes from apoptosis induced by hypoxia.Keywords： hypoxia； apoptosis； nitric oxide；

7、cardiomyocyte長(zhǎng)期以來，人們一直認(rèn)為心肌細(xì)胞壞死是心肌缺血這一過程的病理機(jī)制。隨著細(xì)胞凋亡現(xiàn)象在多種心血管系統(tǒng)疾病(如心衰、心律失常等)的發(fā)現(xiàn)，一些學(xué)者提出，細(xì)胞凋亡可能是心肌缺血損傷機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)1。目前，對(duì)凋亡的研究多集中在腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞，對(duì)于缺氧直接作用于體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞而致其凋亡，國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道，國(guó)外的研究也較少，但這個(gè)問題已開始為許多學(xué)者所重視。NO是目前的研究熱點(diǎn)之一，它被認(rèn)為是重要的氣體第二信使，參與多種生物過程。在對(duì)免疫細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，它既可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也可抑制細(xì)胞凋亡2，3,而其對(duì)缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡有無影響，國(guó)內(nèi)外尚無此方面的報(bào)道。心肌缺血最關(guān)鍵

8、的因素是心肌細(xì)胞缺氧。我們通過在細(xì)胞水平模擬心肌缺血損傷，利用不同的方法，觀察了心肌細(xì)胞在缺氧不同時(shí)間發(fā)生凋亡的情況及NO對(duì)此過程的影響，以探討凋亡發(fā)生率與心肌細(xì)胞缺氧之間的關(guān)系，以及NO對(duì)缺氧引起心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。1材料和方法1.1材料新生SD品系大鼠仔鼠(13d齡)購(gòu)于本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。轉(zhuǎn)鐵蛋白購(gòu)于Gibco公司。Bromodeoxyuridine(Brdu)購(gòu)于Sigma公司。胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司。高糖及低糖DMEM購(gòu)于Hyclone公司。DNA末端標(biāo)記凋亡檢測(cè)試劑盒(ApoAlertTMDNAFragmentationAssayKit)購(gòu)于Clot?ech公司。NO供體

9、S?nitrosopenicillamine(SNAP)及C2?Ceramide購(gòu)于Sigma公司。細(xì)胞周期及凋亡染色試劑(DNA?PrepStain)為Coulter公司的產(chǎn)品。1.2方法1.2.1新生大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)取13d齡SD仔鼠，在其心臟跳動(dòng)時(shí)將心臟取下，經(jīng)膠原酶消化，以高糖DMEM制成單細(xì)胞懸液，用差速貼壁法于3750mL/LCO2孵箱中培養(yǎng)45min。由于纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞更易于貼壁，用此法可使大部分纖維細(xì)胞貼壁，剩下富含心肌細(xì)胞的培養(yǎng)液。將此培養(yǎng)液離心，再次接種于含100mL/L胎牛血清、0.1mmol/LBrdu的高糖DMEM中，細(xì)胞密度約為5×108個(gè)/L。其中

10、胎牛血清可進(jìn)一步促進(jìn)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而Brdu可抑制纖維細(xì)胞增殖。按此法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，培養(yǎng)后12h即可見部分細(xì)胞收縮。24h后換液，換用含轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素的高糖DMEM，去除血清和Brdu，此時(shí)心肌細(xì)胞約90以上都在收縮，速率達(dá)96120次/min。1.2.2缺氧條件下培養(yǎng)心肌細(xì)胞首先，將高純度氮?dú)?N2)通入低糖DMEM中30min。取生長(zhǎng)4d的單層心肌細(xì)胞，換用N2飽和的低糖DMEM，將心肌細(xì)胞分為兩組，其中一組加入SNAP，使其終濃度為100mol/L。兩組同時(shí)放入3750mL/LCO2，950mL/LN2孵箱中，在此缺氧條件下分別培養(yǎng)16，32和48h。1.2.3HE及TUNEL染色

11、取心肌細(xì)胞爬片，用950mL/L乙醇固定、常規(guī)HE染色。另取一些心肌細(xì)胞爬片，以40mL/L甲醛/PBS于4固定25min。將細(xì)胞爬片浸入2mL/LTriton?X-100/PBS液中，使細(xì)胞通透性增強(qiáng)，加用熒光素FITC標(biāo)記的核苷酸和脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的混和液，于37作用60min。在熒光顯微鏡下觀察,以核陽性作為結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)。陰性對(duì)照為不加TdT液處理的細(xì)胞,陽性對(duì)照為以終濃度100mol/L的C2?Ceramide處理4h的細(xì)胞。1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率分別取正常條件下培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和缺氧條件下不同時(shí)間培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，加入SNAP后在正常條件下培養(yǎng)的心肌細(xì)胞及加入SN

12、AP后在缺氧條件下培養(yǎng)不同時(shí)間的心肌細(xì)胞。經(jīng)2.5g/L胰蛋白酶消化后，用0.01mol/LPBS洗滌2次，并以PBS調(diào)整細(xì)胞密度為1×109個(gè)L，制成單細(xì)胞懸液,加入2mL預(yù)冷的無水乙醇固定細(xì)胞4。上機(jī)前，收集所有固定標(biāo)本，離心去上清，用PBS洗2次，調(diào)整至終體積為100L。加入DNA?Stain染色液500L，于室溫下避光染色20min，用EliteESP型流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量的變化，分析細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的變化。2結(jié)果2.1HE及TUNEL染色HE染色可見凋亡細(xì)胞的體積變小、胞核濃縮、胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)(1)。TUNEL陽性信號(hào)為黃綠色或黃色熒光，位于胞核，呈小圓形、環(huán)形或新月

13、形(1)。經(jīng)C2?Cer?amide作用的陽性對(duì)照呈陽性，去除TdT液的陰性對(duì)照呈陰性。1缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的HE及TUNEL染色Fig 1 Determination of hypoxia? induced cardiomyocyte apoptosis by HE and TUNEL staining A:HE staining(× 200); B:HE staining(× 400);C:TUNEL staining(× 200);D:TUNEL staining(× 400). 2.2流式細(xì)胞儀的分析缺氧不同時(shí)間后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示明顯的

14、凋亡峰(2)。缺氧培養(yǎng)16，32和48h后，心肌細(xì)胞的凋亡率分別為：(2.9±0.5)，(6.2±0.8)和(26.6±3.0);加入NO供體后其凋亡率分別為：(0.2±0.3)，(3.4±0.4)和(11.8±1.2)。經(jīng)?2檢驗(yàn)，缺氧組與正常培養(yǎng)組之間、缺氧各組之間凋亡率有明顯的差異(P0.01)；缺氧相同時(shí)間，加入SNAP組與未加入組之間，凋亡率亦有明顯的差異(P0.01)。2心肌細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀分析Fig2AnalysisofcadiomyocyteapoptosisbyflowcytometerN:Normalcondi

15、tion;H:Hypoxia.3討論越來越多的證據(jù)表明，心力衰竭、心律失常和心肌病等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡現(xiàn)象有關(guān)?？梢哉f，凋亡在心臟的正常生理、病理過程中幾乎無處不在。本實(shí)驗(yàn)表明，在心肌缺血損傷中，細(xì)胞凋亡也有著重要的病理學(xué)意義。從本研究的結(jié)果來看，單純?nèi)毖跫纯烧T導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，心肌細(xì)胞在缺氧16h及32h時(shí)，凋亡率分別為：2.9±0.5和6.2±0.8；而在缺氧48h時(shí)，凋亡率增至26.6±3.0。以上提示，在心肌缺血性疾病治療中，一方面要在缺血早期及時(shí)改善心肌細(xì)胞的血液供應(yīng)；另一方面要采取細(xì)胞保護(hù)措施，即抑制細(xì)胞凋亡，改善其功能狀態(tài)。

16、細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)的信號(hào)依賴性過程，目前人們已在不同的環(huán)節(jié)發(fā)現(xiàn)了一些介導(dǎo)凋亡的信號(hào)通路和分子，但凋亡的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)錯(cuò)綜復(fù)雜，現(xiàn)在仍未明確。關(guān)于心肌細(xì)胞缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡的研究起步較晚，其信號(hào)通路更是知之甚少。隨著對(duì)凋亡信號(hào)通路的揭示，將使我們有可能采取干預(yù)手段影響凋亡信號(hào)傳遞過程，促進(jìn)或抑制凋亡，從本質(zhì)上治療疾病。NO是重要的氣體第二信使，本研究發(fā)現(xiàn)，它對(duì)于體外缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用，這為長(zhǎng)期以來一直用于治療心肌缺血性疾病的硝酸酯類藥物，提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前認(rèn)為，NO與其它凋亡傳導(dǎo)途徑之間存在著對(duì)話效應(yīng)，它有可能作用于心肌細(xì)胞內(nèi)其它介導(dǎo)凋亡的信號(hào)分子(如神經(jīng)酰氨)，通過影響其

17、生成或釋放而發(fā)揮保護(hù)作用。但NO是否對(duì)心肌細(xì)胞凋亡也有雙重作用及其作用機(jī)制如何？尚待進(jìn)一步研究。我們已確立心肌細(xì)胞缺氧損傷模型，揭示了凋亡和心肌細(xì)胞缺氧的關(guān)系，并探討了氣體第二信使NO在這一過程中的保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，我們還將進(jìn)一步研究缺氧心肌細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，以期為臨床上治療心肌缺血、有效的保護(hù)心肌細(xì)胞提供新的思路和手段。作者簡(jiǎn)介：張峰，女，29歲，碩士生西安市長(zhǎng)樂西路17號(hào)，Tel.(029)3374555 ?2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit張峰（第四軍醫(yī)大學(xué)，藥理學(xué)

18、教研室，陜西 西 安 710032）羅曉星（第四軍醫(yī)大學(xué)，藥理學(xué)教研室，陜西 西 安 710032）趙德化（第四軍醫(yī)大學(xué)，藥理學(xué)教研室，陜西 西 安 710032）曹云新（第四軍醫(yī)大學(xué)，中心實(shí)驗(yàn)室，陜西 西 安 710032）參考文獻(xiàn)：1 Thomas NJ. Normal and abnormal consequences of apoptosis in the human heartJ . Annu Rev Physiol, 1998; 60: 309? 325. 2 Fehsel K, Kroncke KD, Meyer KL, et al. Nitric oxide induces apoptosis in