雄黃抑制宮頸癌細(xì)胞株增殖和誘導(dǎo)凋亡的體外研究

1、雄黃抑制宮頸癌細(xì)胞株增殖和誘導(dǎo)凋亡的體外研究    作者：尹伶 濮德敏 吳青 郭孝鵬    【摘要】 目的： 體外研究中藥雄黃主要成分As4S4對(duì)子宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。方法：以As4S4不同濃度 (7.5、15、30、60mg/L)，分12h,24h,36h,48h,60h處理Hela細(xì)胞,用光鏡觀察細(xì)胞變化；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定細(xì)胞增殖抑制率；流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞凋亡率；用DNA梯狀電泳(DNA ladder)檢測凋亡的發(fā)生。結(jié)果：不同濃度 (7.5、15、30、

2、60 mg/L )的As4S4處理的Hela細(xì)胞,細(xì)胞增殖受到抑制，作用呈明顯的時(shí)效和量效關(guān)系，差異有非常顯著性(P<0.01)；As4S4誘導(dǎo)Hela 細(xì)胞的凋亡率為(8.13±1.13)%(62.36 ±4.42)%,與對(duì)照組比較(2.84±1.88)%,差異有極顯著性(P<0.01),并呈濃度依賴性；DNA ladder呈梯狀條帶。結(jié)論： 雄黃體外對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞具有增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用。    【關(guān)鍵詞】 As4S4； 增殖抑制; Hela細(xì)胞; 凋亡 祖國的傳統(tǒng)中藥雄黃是砷劑的一種，主要成分

3、為硫化砷(As4S4)，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有悠久的應(yīng)用歷史。近來中藥砷劑(雄黃、砒霜)在治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)方面取得了明顯的療效13，發(fā)現(xiàn)中藥砷劑具有抗腫瘤作用，其主要機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前對(duì)氧化砷（砒霜）的研究較為廣泛,而對(duì)硫化砷雄黃研究的報(bào)道較少，對(duì)婦科腫瘤的作用未見報(bào)道。    子宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤,由于近年來性傳播疾病的蔓延,宮頸癌的發(fā)病率又有上升和年輕化趨勢(shì)。目前治療宮頸癌以手術(shù)為主, 但根治術(shù)的5年生存率較低,子宮頸癌對(duì)放療的敏感性具有個(gè)體差異,且放療后易出現(xiàn)局部轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā), 因此尋找有效的子宮頸癌化療藥物具有重

4、要意義。本研究對(duì)雄黃的主要成分硫化砷對(duì)人子宮頸癌Hela細(xì)胞體外作用進(jìn)行了探討,旨在為尋找新的有效治療子宮頸癌的藥物提供理論依據(jù)。 1 材料和方法 1.1 材料    人宮頸癌Hela細(xì)胞株購自上?？茖W(xué)院生物細(xì)胞研究所。高純度雄黃As4S4（>95%）由西安交通大學(xué)血液病研究中心提純惠贈(zèng)。5%四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT 溶液,上海華美生物工程公司);苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑、DNA Ladder試劑盒(美國Sigma公司);胰蛋白酶、RMPI 1640 培養(yǎng)基、小牛血清(武漢凌飛生物公司)。 1.2 細(xì)胞形態(tài)觀察  &

5、#160; 每瓶(25cm2) 接種1.5×105細(xì)胞,24后加入不同濃度(7.5、15、30、60mg/L)的As4S4處理,每天用倒置顯微鏡觀察記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)變化。 1.3 MTT 檢測    以每孔1×105 個(gè)Hela細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板, 分為空白組(調(diào)零)、As4S4實(shí)驗(yàn)組(7.5、15、30、60 mg/L mg/L)和對(duì)照組(不加藥物的細(xì)胞)，分別培養(yǎng)12h,24h,36h,48h,60h后加入MTT液，再培養(yǎng)4h，吸棄孔中的培養(yǎng)上清,每孔加入150l DMSO, 混勻10min ,在酶聯(lián)免疫

6、檢測分析儀570nm處測定各孔吸光度值(A), 抑制率(%)=(1- 實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。重復(fù)3次取平均值。 1.4 DNA梯狀電泳(DNA ladder)    培養(yǎng)細(xì)胞離心換液后,經(jīng)冷PBS洗2遍,按照試劑盒說明提取DNA,并溶于無DNA酶的TE液中,20V電泳4h瓊脂糖凝膠電泳后,KODAK DNA analysis 2.0 凝膠成像系統(tǒng)分析。 1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率    用Annexin?V?FITC及PI雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,分為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)

7、組分別加入終濃度為7.5、15、30、60 mg/L 的As4S4作用24h，未加藥組為對(duì)照組，用70%乙醇4固定24h，PBS緩沖液洗去固定液，離心去上清。用緩沖液37孵育60 min，195l細(xì)胞懸液加5l Annexin?V?FITC，混勻，室溫10min。用緩沖液洗滌細(xì)胞1次，在190l緩沖液中重懸，然后再加10l(含20g)碘化丙啶，上流式細(xì)胞儀檢測。 1.6 統(tǒng)計(jì)分析    采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，ANOVA 分析。 2 結(jié)果 2.1 光鏡下Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化    正常

8、生長的Hela細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞，粘附生長于培養(yǎng)瓶壁上，細(xì)胞平坦。    As4S4處理Hela細(xì)胞24h, 7.5 mg/L處理組可見細(xì)胞間有間隙，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯；15 mg/L處理組可見細(xì)胞變圓,體積縮小；30 mg/L處理組可見細(xì)胞間距離增大，圓細(xì)胞增多，細(xì)胞皺縮，核固縮出現(xiàn),核顏色加深,折光性增強(qiáng)；60mg/L處理組可見細(xì)胞脫落懸浮在培養(yǎng)基中。隨著As4S4作用時(shí)間增加，以上變化更明顯，至60h，細(xì)胞壞死。對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長,幾乎無脫落,胞質(zhì)飽滿,生長舒展,相鄰細(xì)胞生長融合成片。    2.2 As4S4

9、 對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響    As4S4以時(shí)間劑量依賴性方式抑制Hela細(xì)胞增殖, 12h、24h、36h、48h、60h后，細(xì)胞抑制率分別如下：7.5mg/L為(23.58±4.65)%、 (30.92±3.79)%、(35.57±4.21)%、(40.18±4.25)%、(46.31±1.90)%；15mg/L為(28.71±5.64)%、(37.58±5.81)%、(46.58±3.92)%、(51.77±1.28)%、(54.22±2.25)%

10、；30mg/L為(40.28±0.67)%、(47.99±4.53)%、(54.82±4.47)%、(61.61±1.81)%、(64.01±4.00)%；60mg/L為(47.27±0.93)%、(58.29±3.83)%、(65.57±3.73)%、(71.88±4.05)%、(79.75±6.14)%，各組差異有顯著性意義(P<0.01)。 2.3 DNA梯狀電泳(DNA ladder)    以不同濃度（7.5、15、30、60mg/L） A

11、s4S4作用Hela細(xì)胞24h,提取 DNA經(jīng)低壓瓊脂糖凝膠電泳后,呈梯狀條帶,見圖1。 1 對(duì)照組； 2 7.5 mg/L As4S4； 3 15 mg/L As4S4； 4 30 mg/L As4S4； 5 60mg/L As4S4 圖1 不同濃度As4S4處理后Hela細(xì)胞的DNA ladder（略） 2.4 As4S4對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響    表1 不同濃度As4S4作用24h對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響（略） 注：* P<0.01。    Hela細(xì)胞經(jīng)不同濃度（7.5、15、30、60mg/L）

12、 As4S4作用24h，隨著As4S4濃度提高,早期凋亡率逐漸增加,其凋亡率分別為(8.13±1.13)%、(29.58±2.51) %、(46.24 ±3.92)%、(62.36 ±4.42)%,與對(duì)照組 (2.84±1.88)% 比較,不同濃度As4S4均能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，后3組濃度誘導(dǎo)凋亡差異有極顯著性 (P<0.01),并呈濃度依賴性，見表1。 3 討論    腫瘤不僅是增殖和分化異常的疾病,也是凋亡異常的疾病。已證實(shí)細(xì)胞凋亡減少或不凋亡等可引起腫瘤的發(fā)生,故細(xì)胞凋亡普遍存在于大多數(shù)腫瘤組

13、織中,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及退化有密切的關(guān)系3,因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為近來腫瘤治療的重點(diǎn)4。    宮頸癌的發(fā)生發(fā)展也與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和腫瘤細(xì)胞的凋亡減少有關(guān),近年來隨著對(duì)細(xì)胞凋亡研究的深入和發(fā)展,人們逐漸認(rèn)識(shí)到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是治療腫瘤性疾病的一種有效的方法和手段，許多抗腫瘤藥物都是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的4。含砷中藥逐漸得到大家的注目,三氧化二砷在血液系統(tǒng)腫瘤方面療效顯著，其治療范圍逐漸從少數(shù)白血病向其他白血病及實(shí)體腫瘤擴(kuò)展。但三氧化二砷為劇毒性藥物,毒副作用較大;而同屬砷制劑的雄黃的毒性要比三氧化二砷低得多,其價(jià)值備受關(guān)注，有

14、關(guān)雄黃誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及機(jī)制的研究有所報(bào)道5,6?，F(xiàn)研究較多的是雄黃能抑制不同類型惡性血液病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，對(duì)實(shí)體腫瘤細(xì)胞有類似作用。因此抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡是雄黃抗腫瘤作用的一種比較明確的機(jī)制。陳思宇, 張晨7，8等研究發(fā)現(xiàn)雄黃能抑制血液病細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制與雄黃上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl?2和P?gP，增加細(xì)胞膜HSP70蛋白表達(dá)有關(guān)。鄒春芳，張晨9，10等用雄黃分別對(duì)實(shí)體瘤肺腺癌SPC?A?1、肝癌細(xì)胞系BEL?7402進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)雄黃能抑制上述癌細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期。    本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)研究雄黃主要成分硫化砷

15、（As4S4）抗腫瘤作用,表明其能有效抑制Hela細(xì)胞增殖,并能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，且呈明顯的量效關(guān)系和時(shí)間依賴性。 FCM顯示, 硫化砷處理后凋亡細(xì)胞所占比例明顯增高,這與文獻(xiàn)報(bào)道硫化砷誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞BEL?7402凋亡一致9，10。以不同濃度As4S4作用Hela細(xì)胞24h,提取 DNA經(jīng)低壓瓊脂糖凝膠電泳后,呈梯狀條帶。因此，通過體外研究初步顯示，雄黃對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞具有增殖抑制作用和促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，且呈明顯的量效關(guān)系和時(shí)間依賴性。雄黃如何抑制腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)其凋亡的，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)可為雄黃抗實(shí)體腫瘤的研究，為進(jìn)一步開發(fā)雄黃的藥用價(jià)值提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【

16、參考文獻(xiàn)】 1 Chen SY, Li XM, Liu SX. Over view of the advance in the research of traditional chinese medicine containing arsenic for the treatment of malignant hematologic disease. China Journal of Chinese Materia Medica , 2000，25(8):454.2 Wang ZY. Arsenic compound sasantic cancer agents. Cancer Chemothe

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