顯微鏡熒光波長詳解

1、人肉眼對光源波長的顏色感覺紅色 770-622 nm橙色 622597 nm黃色 597577 nm綠色 577492 nm藍靛色492455nm紫色455350nm熒光類型生產(chǎn)廠家激發(fā)光（nm）發(fā)射光（nm）顏色GFP蛋白395-495509綠色EGFP蛋白487509綠色DAPI358-360460-461藍色Alexa Fluor 488In vitroge n495519綠色Alexa Fluor 594In vitroge n590617紅色FITC490-495520-530黃綠色羅丹明(Rhodam ine)565590紅色TRITC （Tetramethyl Rhodam in

2、Isothiocyanate,四甲 基異硫氰酸羅丹明， 是羅丹明的一種衍 生物之一）550620橙紅色Rhodam ine Red-X(RRX)570590橙紅色Texas Red(TR)589-595615橙紅色常見顯微鏡濾光片的波長在激發(fā)波長在Ex范圍內(nèi)才能被激發(fā)，只有發(fā)射光波長大于BA/EM才能被觀察到，背景光的波長只有大于DM才能被觀察到。紅色濾光片G-2AEx 510-560DM 575BA 590綠色濾光片B-2AEx 450-490DM 505BA 520藍色濾光片UV-2AEx 330-380DM 400BA 420其它熒光染料介紹【菁類染料 -Cyanine dyes( Cy

3、2 , Cy3 , Cy5 )】Cy2 耦聯(lián)基團激發(fā)波長為 492nm ，發(fā)光為波長 510nm 的綠色可見光。 Cy2 和 FITC 使用相 同的濾波片。由于 Cy2 比 FITC 在光下更穩(wěn)定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑， 因為這種抗淬滅劑和 Cy2 反應，在染色片儲存后會導致熒光微弱和擴散。 Cy3 和 Cy5 比其 他的熒光團探針要更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。 Cy3 耦聯(lián)基團激發(fā)光的最大波長為 550nm ， 最強發(fā)射光為 570nm 。因為激發(fā)光和發(fā)射光波長很接近 TRITC, 在熒光顯微鏡中，可使用 和 TRITC 一樣的濾波片。Cy3 在氬光燈 (514nm 或 528n

4、m) 下可以被激發(fā)出 50 的光強，在氦氖燈 (543nm) 或者汞燈 (546nm) 下則約 75 。 Cy3 可以和熒光素一起作雙標。 Cy3 還可以和 Cy5 一起在共聚焦顯 微鏡實驗中作多標記。 Cy5 耦聯(lián)基團的激發(fā)波長最大 650nm ，發(fā)光波長最大 670nm 。在氪 氬燈(647nm)下它們可被激發(fā)出 98 %的熒光，在氦氖燈下(633nm)為63 %。Cy5可以和很 多其他的熒光基團一起用在多標記的實驗中。由于它的最大發(fā)射波長在670nm ， Cy5 很難用裸眼觀察，而且不能用汞燈作理想的激發(fā)。通常觀察 Cy5 時采用具有合適激發(fā)光和遠紅 外檢測器的共聚焦顯微鏡。 在水相封片

5、劑中應當加入抗淬滅劑。 使用傳統(tǒng)的表面熒光顯微鏡 時，不推薦使用 Cy5 。【藻紅蛋白或藻膽色素蛋白 -Phycoerythrin(PE) 熒光標記二抗】 存在于被稱為藻紅的多聚微粒中， 位于葉綠素的反應中心， 在自然結(jié)構中， 藻紅蛋白吸收光 能，吸收后轉(zhuǎn)化成能量， 供其發(fā)育生長。 當藻紅蛋白被分離和純化后， 其蛋白質(zhì)變得具有很 強的熒光， 能吸收不同波長的光，發(fā)出亮紅色的熒光，此時不再接受任何外來的光，也不能 轉(zhuǎn)移光能。藻紅蛋白 PE 的吸收波長范圍較廣，最大的吸收波長為 566nm ，最大的發(fā)射波 長為 574nm 。藻紅蛋白作為熒光標記物具有以下優(yōu)點：首先具有強的長波長激發(fā)和發(fā)射熒 光，

6、可避免來自其他生物材料熒光的干擾；并且具有極高的發(fā)射量子產(chǎn)率；另外PE 具有非常高的水溶性而且與許多生物學或合成材料的多位點穩(wěn)定交聯(lián)?！?Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】耦聯(lián)的 AMCA 吸收光波長最大為 350nm ，發(fā)熒光則為 450nm 。對于熒光顯微鏡來說， AMCA 可以用汞燈來激發(fā)，用紫外濾板來觀察。由于 AMCA 的信號相對較弱，單標實驗中不推薦 使用 AMCA 。 AMCA 和熒光素的熒光波長只有很小的重疊范圍，而和發(fā)出長波長熒光的熒 光基團沒有或者只有極少的重疊， 因此它最常用于多標記實驗中， 比如免疫熒光顯微鏡和流 式細胞儀。由于人眼不

7、能很好的檢測藍色熒光，在多標記的實驗中，AMCA 耦聯(lián)的二抗應當被用于檢測大量的抗原。 AMCA 和熒光素一樣很快淬滅，使用抗淬滅劑可以減輕。且由 于肉眼不能很好的檢測 AMCA 所激發(fā)的藍色熒光， 因而 AMCA 耦聯(lián)的二抗更適用于檢測大量存在的抗原。如果使用在流式細胞儀中，AMCA可以用汞燈或者水冷卻的氬光燈激發(fā)，因為它們發(fā)出的光線是在光譜的紫外區(qū)。注：由于觀察熒光需要一定波長的激發(fā)光，必須根據(jù)實驗室已有的儀器可發(fā)光的波段進行選擇。另外，多標記中對探針色彩區(qū)分程度的要求。例如，若丹明紅-X (RRX)和德克薩斯紅(TR)熒光素的區(qū)別就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的區(qū)別明顯。如果對

8、靈敏度有更高的要求，貝U Cy3和Cy5就比其他的熒光團探針要亮。西美杰備有全面的二抗現(xiàn)貨產(chǎn)品并能提供最完整的二抗產(chǎn)品線。主要二抗品牌為全球最大的二抗和底物生產(chǎn)廠商 KPL以及前沿抗體生產(chǎn)商Prote in Tech。針對熒光標記二抗，有FITC、TRITC、Rhodamine、PE、Cy3/5、AMCA、Dylight等多種熒光標記二抗；按照檢測物種分，有抗人、大鼠、小鼠、豬、驢、綿羊、山羊、小雞、馬、兔、倉鼠、狗、牛，以及多種細菌類二抗；另外，還有 IgG、IgA、IgM以及IgG(Fc)、lgG(ab ' )2等不同類型抗體。The role of filters in epi-

9、fluorescenee microscopy在激發(fā)波長在Ex范圍內(nèi)才能被激發(fā)，只有發(fā)射光波長大于BA/EM才能被觀察到，背景光的波長只有大于DM才能被觀察到。ToDichroic miirorLight from mencury tampWoiSE temnprwtw 曲filterTo obervatnn sysTerm(Ey«.eu.)Fluarcsccnce filter block (for inverted microscope)Excitatian filterFigure 1As shown in Figure 1, filter blocks are constru

10、cted from 2 types of filters and 1 dichroic mirror. Selecting appropriate filters and mirrors for each use allows researchers to atta in a high sig nal to no ise (S/N) ratio betwee n the fluoresce nee and backgro und light. The fun cti ons of these optical eleme nts are described below.熒光濾色塊組示意圖。每個濾

11、色塊組有一個半透半反鏡， 一個激發(fā)光濾光片，兩 個發(fā)射光濾光片。如前面介紹的，由光源發(fā)出的光透過激發(fā)光濾光片進入濾色塊 組，被半透半反鏡反射；發(fā)射出的熒光透過發(fā)射光濾光片進入目鏡或相機。在這一組合中，半透半反鏡以及左側(cè)的發(fā)射光濾光片是固定在架子上的，而右側(cè)的發(fā)射光濾光片則安裝在一個可以拆卸的濾片框內(nèi)。只要松動螺絲，就可以拆下右側(cè)的濾片框，然后根據(jù)需要，更換半透半反鏡。更換時需要注意，不要把固定用的 膠水，涂到半透半反鏡上，操作要帶手套，避免將指紋留在鏡面上。上述體視鏡可搭配3各熒光濾色塊，以及一個用于明場觀察的無濾片塊。觀察時，可通過拉動杠桿調(diào)節(jié)濾色塊的位置， 每一個濾色塊配有不同的標識，便于

12、 選擇。Figure 3Barrier Fitter*-Excitation FitterFilter (Left Cbannel)r恤r k FrameNikon SMZ1500 StereomicgcopE Fluorescence Filter CombinationDichromatic MirrorExcitation Light to SpecimenFitter FrameScrewExcitation filter (EX)激發(fā)光Excitation filter example: EX4S0-490 FiBure100SO£040200400 450 500 5S0

13、 600 S50 700>Vavf-length (nnr)The excitation filter is the optical element that passes only the wavelen gth of light n ecessary for excitati on from the excitati on light source (usually a mercury lamp) to the fluorophore. As shown in Figure 2, only the excitation wavelength passes through the fi

14、lter, usually a "band pass filter".Dichroic mirror (DM)400 450 50C 55C £00 £50 700 wavcjlength (rml(眾)2u沖匚 el-in cide neeThe dichroic mirror is the optical element that separates the excitation light from the fluoresce nee. Dichroic mirrors are special mirrors that reflect only a

15、 specific wavelength of light, allowing all other wavelen gths to pass through (Figure 3). Dichroic mirrors used in epi-fluoresce nee microscope filter blocks are placed in a 45 an gle to light, creat ing a "stop ban d"of reflected light and a "pass band"of transmitted light. Lig

16、ht passing through the excitation filter is reflected 90 toward the objective and the specime n. Fin ally, light ema nati ng from the specime n is passed through and directed toward the observer (or high-se nsitivity camera).Barrier filters (BA) or emission (EM) filters1廠!g a11一 Bio1h Iran srrirtted

17、qeked i-1 ><11j i!ihj.jBarrier filter example： BA520 Figure4 ICCao6C46200400 450 500 5S0 SCO «50 700Wavlejnoth rm)Barrier filters are optical eleme nts that separate fluoresce nee ema nat ing from the fluorophore from other backgro und light. As show n in Figure 4, the barrier filter tran

18、 smits light of the fluoresce nee wavelen gth which passes through the dichroic mirror while block ing all other light leaking from the excitation lamp (reflected from the specime n or optical eleme nts). This is n ecessary because the stre ngth of the fluoresce nt light is weaker tha n the excitati on light by a factor of more than 100,000:1. Most barrier filters are positioned at a slight an gle to allow better fluor